寡核苷酸（后面简称引物）的制备是通过使用 DNA 合成仪完成的，合成仪本质上是一套由计算机控制的试剂递送系统。第一个碱基将会被连接至固体支持物（通常是玻璃或聚苯乙烯微珠），该支持物旨在锚定反应柱中不断延长的 DNA 链。DNA 合成由一系列的 化学反应 所组成，不同于酶促的DNA合成过程从5'→3'方向延伸，而是由3'→5'方向进行。
有些实验员还搞不清楚引物5'端到底有没有磷酸基团，从第6步的过程看，最后一个碱基5'端DMTr保护基团清除后，暴露出来的是5’-OH，是没有磷酸基团的，不能够直接用于3'-5'连接反应，这是合成方法本身局限的，如果你需要带5'端磷酸的引物，就需要告诉合成公司进行修饰，也可以自己用磷酸化酶处理。
所有的化学反应都不是100%进行的，即使是最彻底的中和反应也是处于动态平衡的，那么引物合成过程中会产生那些干扰呢？下面我们来看看，反应不彻底会产生什么样的影响？
引物合成过程中，会产生各种各样的副产物，大多数副产物基本可以忽略，但短片段的比例是不容忽视的，一般的偶联步骤效率在99%左右，25nt的引物，全长的比例=0.99 24 =78.6%，每种短片段的比例接近0.99%，一般PCR体系中，引物的使用浓度为0.2-0.5uM，这样的浓度下短片段的数目也是很大的，这些短片段可能结合在非目的区，往往导致非特异条带的产生，甚至克隆失败。为了避免这种缺陷，引物合成之后需要对应的纯化步骤，去除小片段，这对较高要求的PCR和分子克隆是十分必要的。
引物是PCR成功与否最重要的影响因素之一，影响PCR成功率的因素我们后面还会讨论。一般来说，在引物区发生突变的概率不大，但是偶尔也会发生，合成公司一般都有对应的赔偿措施，但花费的时间精力是你的，因此进行比较重要的实验时，尽量不要在引物合成上节约成本。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
引物合成是通过测定引物的OD值，溶解引物，最终合成引物的一个完善的过程。目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。金开瑞生物提示你，亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
