简述PCR技术操作步骤

PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）的缩写，它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段两端的小片段引物，在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行，在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成。

主要的技术步骤是：

（1）DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。

（2）引物与靶DNA退火 适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。

（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。

PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段可看作生物体外的特殊DNA复制

DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of EColi 则是于70年代的初期由DrHKlenow 所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应现今所使用的酶(简称 Taq polymerase),则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的 酶,但它被广泛运用则于80年代之后PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由 DrKjell Kleppe 提出他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验而现今所发展出来的PCR则于1983由 DrKary BMullis发展出的,DrMullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位DrMullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖

　标准的PCR过程分为三步（如图所示）：

1DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下,

氢键断裂,形成单链DNA

2退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低,引物与

DNA模板结合,形成局部双链

3延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活

性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延

伸,合成与模板互补的DNA链

每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍

现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度

pcr过程是包括高温变性，低温退火，中温延伸三个不同的事件。变性加热使模板DNA在高温下双链间的氢键断裂而形成两条单链。退火使溶液温度降至50到60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，延伸溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸。

pcr含义概况

聚合酶链式反应PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史残骸，还是所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。

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