1PCR技术基本原理:PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加
热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引
物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合
物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA
链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
3PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
4PCR的特点:特异性强。对标本的纯度要求低。灵敏度高。
5PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③Taq
DNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
pcr即聚合酶链式反应,具体解释就是:
Taq
DNA聚合酶依赖DNA模板,在引物的引导下,不断地利用dNTP(脱氧核糖三磷酸)合成目标片段的过程。
步骤:
变性(95℃左右)
利用高温使加入的模板双链打开
退火(55℃左右)
降低温度,使引物与模板特异性结合
延伸(72℃左右)
Taq酶耐热,此温度活性最强,接着引物再继续合成DNA
实质就是模仿了生物体内的DNA合成过程
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时 聚合酶链式反应
间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
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