设计PCR引物的主要原则是什么

pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则分述如下：

1、pcr的技术的主要步骤：

①dna变性：（90℃-96℃）：双链dna模板在热作用下，氢键断裂，形成单链dna

②退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与dna模板结合，形成局部双链。

③延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的dna链。

每一循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍。如图所示：现在有些pcr因为扩增区很短，即使taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

2、引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c

过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

③引物内部不应出现互补序列。

④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3

′端的互补重叠。

⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是g和c。

⑦引物的5

′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

引物是一小段核苷酸。PCR中，两个引物分别与目地DNA的2条子链的两端互补，也就是如果从图的平面来看：一个引物与上一条链的左端互补，另一个引物与下一条子链的右端互补。

所以两个引物的序列是不相同的，这样才不会乱。

引物的作用：有了引物分别与子链互补，那些单个的脱氧核苷酸才能够开始连接上去。

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位

10uM浓度的引物，加个1ul足矣。在PCR反应中，经过n次循环，理论上DNA链的数目扩增了2的n次方。PCR的一个循环，一个DNA模板被复制为2个DNA片段。

PCR循环次数通常就是30左右。循环数太多了，虽然在一定程度上能够提高产物量，但是由于反应时间过长。

有一些非特异产物的扩增也会相应增加；而且随着酶的扩增能力下降,合成目标片段的能力也会随之下降,也可能引起其他的非特异性扩增。

扩展资料：

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。

模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。

参考资料来源：百度百科-聚合酶链式反应

引物是PCR反应中非常重要的一环，我认为引物对PCR的影响主要体现在2方面：

1，影响PCR的特异性，也就是说，所扩增的片段能否是你想要的特异性目的片段，而不是非特异性杂带，一般来说，引物与模板序列匹配的越多，其特异性越好，但引物并不是越长越好，其原因就是下一个方面；

2，影响PCR的效率，在退火环节中，引物越长，退火的反应就越慢，过长时就会阻碍PCR反应的顺利进行，而引物短，则能更快的使引物与模板结合，但其特异性就下降，有可能会出现“乱搭”的情况；

除此之外，引物的GC含量以及引物二聚体的存在，也会影响PCR反应，但我认为主要的还是上述2方面（因为如果不考虑酶切位点的情况，往往目的片段已定时，引物序列能调整的主要就是其长度），所以需要根据模板的情况和目的片段特点，选择合适长度和起始的引物，对PCR的顺利进行是很有帮助的。

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