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现有的培养雨生红球藻的方法中，游动细胞阶段和静止孢子阶段在同一个反应器中进行，雨生红球藻的游动细胞没有被分离。主要原因是:考虑到雨生红球藻游动细胞的形态和存活特点，本领域技术人员普遍认为，在游动细胞阶段分离雨生红球藻是不可能的，而且，处于游动细胞阶段的雨生红球藻一旦分离，极有可能伤害雨生红球藻游动细胞，甚至影响雨生红球藻游动细胞的存活。然而，本发明的发明人在研究中意外地发现雨生红球藻游泳细胞可以被过滤或重力沉降，然后在固定孢子阶段在不同的反应器中培养。该培养过程不仅不伤害雨生红球藻游泳细胞，而且运行稳定，质量控制容易，培养过程中所有培养液均可循环使用，培养成本低，不会产生废液排放和环境污染问题。
因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种雨生红球藻的培养方法，该方法包括:
(1)在游泳细胞阶段培养雨生红球藻；
(2)当藻液的OD680值为0.01-10时，分离至少部分藻液，得到分离的清液I和雨生红球藻游动细胞，分离的清液I返回步骤(1)重复使用；
(3)将步骤(2)得到的雨生红球藻游动细胞培养在静止孢子阶段；
(4)待培养物完全变红后，分离得到分离清液II和固定化雨生红球藻孢子，分离清液II返回步骤(3)重复使用；
(5)干燥雨生红球藻固定孢子，得到雨生红球藻产品；
在步骤(2)中，分离方式为过滤分离或重力沉降分离。
本发明的方法可以实现雨生红球藻游动细胞的连续培养，进而实现雨生红球藻固定孢子的半连续培养。该培养工艺运行稳定，质量易于控制，培养过程中所有培养液均可循环使用，培养成本低，无废液排放和环境污染问题。
本发明的其他特征和优点将在下面的详细描述中详细描述。
详细实施模式
下面将详细描述本发明的具体实施例。应当理解，这里描述的具体实施例仅用于说明和解释本发明，而不是用于限制本发明。
本发明提供了一种雨生红球藻的繁殖方法，包括以下步骤:
(1)在游泳细胞阶段培养雨生红球藻；
(2)当藻液的OD680值为0.01-10时，分离至少部分藻液，得到分离的清液I和雨生红球藻游动细胞，分离的清液I返回步骤(1)重复使用；
(3)将步骤(2)得到的雨生红球藻游动细胞培养在静止孢子阶段；
(4)待培养物完全变红后，分离得到分离清液II和固定化雨生红球藻孢子，分离清液II返回步骤(3)重复使用；
(5)干燥雨生红球藻固定孢子，得到雨生红球藻产品；
在步骤(2)中，分离方式为过滤分离或重力沉降分离。
在本发明的方法中，步骤(1)优选在游泳细胞培养装置中进行，所述游泳细胞培养装置是开放式光生物反应器或封闭式光生物反应器。对开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器没有特别的限制，可以是本领域常用的各种开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器。例如，开放式光生物反应器可以是跑道光生物反应器或箱式光生物反应器；开放式生物反应器的材料可以是金属、水泥、无机玻璃、有机玻璃或塑料，塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。优选地，开放式光生物反应器是透明的聚丙烯箱或水泥池。封闭式光生物反应器可以是气泡光生物反应器、气升式光生物反应器、搅拌式光生物反应器等。封闭式光生物反应器的材料可以是无机玻璃、有机玻璃或透明塑料，透明塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。优选地，封闭式光生物反应器是自清洁气泡聚氯乙烯光生物反应器。
在本发明的方法中，对雨生红球藻种和培养液没有特别的限制，它们可以是本领域常用的各种雨生红球藻种和培养液，这些是本领域技术人员熟知的，在此不再重复。
在本发明的方法中，本领域技术人员应该理解，在实际的雨生红球藻培养过程中，培养温度、光照强度和培养液的pH值往往不能控制在一个精确的点值，而是在一个范围内波动。优选地，在步骤(1)中，培养条件包括:温度为15-25℃，光照强度为1000-5000Lux，pH值为6-8。其中，培养条件还包括:培养过程中引入的碳源为含有二氧化碳的气体，气体中二氧化碳的含量为1-20重量%，优选2-10重量%，更优选3-8重量%。照明时，光源可以是自然光，也可以是人工光源(如LED光源)，最好是自然光。含二氧化碳的气体可以是高纯度二氧化碳或由工业过程排放的含二氧化碳的气体，并且由工业过程排放的含二氧化碳的气体可以包括由发电厂和炼油厂排放的含二氧化碳的气体。优选地，含二氧化碳的气体是高纯度二氧化碳或炼油厂制氢尾气。本领域技术人员应该理解，含有二氧化碳的气体在进入游泳细胞培养装置之前需要净化以除去固体颗粒并冷却。
在本发明的方法中，优选地，在步骤(2)中，藻液的OD680值为0.05-5，更优选为0.1-1。
在本发明的方法中，优选地，在步骤(2)中，至少部分藻液占总藻液体积的20-50%。
在本发明的方法中，优选地，在步骤(2)中，将至少部分藻类液体转移到分离和储存装置中进行分离。对传输模式没有特别的限制，可以是本领域常用的各种传输模式。其中，转移方式优选为重力转移、溢流转移或虹吸转移，更优选溢流转移。
在本发明的方法中，优选地，在步骤(2)中，分离方式为过滤分离。过滤方法可以是常压过滤分离、加压过滤分离和真空过滤分离，更优选常压过滤分离。
在本发明的方法中，分离储存输送装置优选为圆柱形分离空塔，圆柱形分离空塔的高径比为1-10∶1，更优选为1.5-5∶1，圆柱形分离空塔的底部设有过滤介质。过滤介质没有特别的限制，可以是本领域常用的各种过滤介质。优选地，过滤介质是玻璃砂、滤布或滤纸，更优选地是玻璃砂；过滤介质的孔径为1-60μm，更优选为10-30 μ m
在本发明的方法中，圆柱形分离空柱优选配备有搅拌器，进一步优选搅拌器是锚式搅拌器、框架搅拌器或螺旋带搅拌器，甚至更优选框架搅拌器。
在本发明的方法中，本领域技术人员应当理解，分离、储存和运输装置的数量取决于游泳细胞培养装置和固定孢子培养装置的体积，并且可以是一个或多个平行操作。
在本发明的方法中，优选地，将分离后的清液I返回步骤(1)重复使用的方式包括:将分离后的清液I与补充(新鲜)培养液在培养基罐中混合，并返回游泳细胞培养装置。
在本发明的方法中，步骤(3)优选在固定孢子培养器中进行，并且固定孢子培养器是开放式光生物反应器或封闭式光生物反应器，优选开放式光生物反应器。对开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器没有特别的限制，可以是本领域常用的各种开放式光生物反应器和封闭式光生物反应器。例如，开放式光生物反应器可以是跑道光生物反应器或箱式光生物反应器；开放式生物反应器的材料可以是金属、水泥、无机玻璃、有机玻璃或塑料，塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。优选地，开放式光生物反应器是透明的聚丙烯箱或水泥池。封闭式光生物反应器可以是气泡光生物反应器、气升式光生物反应器、搅拌式光生物反应器等。封闭式光生物反应器的材料可以是无机玻璃、有机玻璃或透明塑料，透明塑料可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。
在本发明的方法中，在优选的情况下，在步骤(3)中，将雨生红球藻游动细胞和分离的清液II在分离和储存装置中混合，然后转移到固定孢子培养器中进行固定孢子阶段培养。此外，优选地，向固定孢子繁殖体的转移模式是虹吸转移或真空转移，甚至更优选真空转移。
在本发明的方法中，对雨生红球藻进行胁迫以积累油和虾青素的方式没有特别的限制，可以使用本领域常用的各种方式。例如，在步骤(3)中，培养方式可以是温度胁迫培养、光照胁迫培养或胁迫因子胁迫培养。优选地，培养模式是具有应激剂的应激培养。进一步地，优选地，胁迫剂胁迫培养的条件包括:pH值为7-9，温度为24-30℃，光照强度为5000-15000勒克斯，胁迫剂为钠盐，胁迫剂的添加量为每升培养液0.005-0.05摩尔，更优选为0.02-0.05摩尔；每升混合藻液；甚至更优选地，应激剂是碳酸氢钠。
在本发明的方法中，本领域技术人员应当理解，不动孢子培养器的数量应当与游动细胞培养器中不动的红球藻的生长周期、收获周期、收获数量、积累油和虾青素的生长周期相匹配，并且可以是一个或多个平行操作，优选2-5个。
在本发明的方法中，优选地，在步骤(3)中，转移完成后，用去离子水将分离储存装置清洗至中性，用于下一次分离转移，清洗液储存备用。例如，清洗液可以被送到清洗液罐中储存。
在本发明的方法中，优选地，将清洗液循环至步骤(3)，进一步优选地，循环方式包括:将清洗液与雨生红球藻游动细胞在分离储存装置中混合，然后转移至固定孢子培养装置中进行固定孢子阶段培养；或者回收方式包括:将清洗液转移到固定孢子培养器中，用于在固定孢子培养过程中补充水分。
在本发明的方法中，本领域技术人员应该理解，在步骤(4)中，可以通过光学显微镜观察不动孢子的红色状态，当不动孢子从外围向中心变红时，可以将它们分离。
在本发明的方法中，优选地，在步骤(4)中，分离方式为离心分离、过滤分离或重力沉降分离，更优选重力沉降分离。
在本发明的方法中，优选情况下，将分离后的清液II返回步骤(3)重复使用的方式包括:将分离后的清液II通过泵输送至分离储存装置，并与分离后的雨生红球藻游泳细胞混合均匀。此外，优选地，分离清液II通过离心泵输送。本领域技术人员可以理解，为了便于分离后的清液II的再利用，可以将分离后的清液II储存在清液罐中备用。
在本发明的方法中，在步骤(5)中，可以将固定化的雨生红球藻孢子送至浓缩槽，然后干燥。干燥方法没有特别限制，但可以是本领域常用的各种干燥方法。优选地，干燥方法是自然干燥、真空空干燥或喷雾干燥，更优选旋风喷雾干燥。
例子
将在以下实施例中详细描述本发明，但是本发明不限于此。
雨生红球藻购自中国科学院武汉水生生物研究所。
藻液光密度值(OD值)的测定:用分光光度计测定光密度值，以蒸馏水为对照，测定藻液在680nm波长处的吸光度值作为藻液浓度的指标。
BG11培养基用于培养，培养基的成分如表1-表2所示。NaNO3是BG11培养基中的氮源。
表1BG11培养基
成分，mg/lk2 hpo 4·3h2o 40 no 31500 na 2co 3·20 mgso 4·7h2o 75
氯化钙2H2O36柠檬酸6柠檬酸铁铵6EDTA-2Na1微量元素A51
表2微量元素A5
组成:mg/lh3bo 32860 mncl 2·4h2o 1810 znso 4·7h2o 22 cuso 4·5h2o 79 namoo 4·5h2o 390 co(NO3)2·6h2o 50
炼厂制氢尾气为中国石化石家庄炼化公司炼厂制氢尾气，二氧化碳含量为20-25重量%。在使用前，它被净化以除去固体颗粒并冷却。冷却至25℃后，与空气体混合形成混合气体，使混合气体中二氧化碳的含量为6%重量。在雨生红球藻的培养过程中，通过控制混合气体的入口流量来控制pH值。
封闭式光生物反应器为PVC薄膜袋，直径220mm，高1500mm，容积35L，无内置导流管。
开放式光生物反应器是一个透明的聚丙烯盒子，体积为20L，受光面积为0.095m2。
雨生红球藻培养率(g/m2/d) =雨生红球藻干重/雨生红球藻游泳细胞培养阶段的光照面积/雨生红球藻游泳细胞培养阶段的培养时间。
分离储存输送装置为30L有机玻璃圆柱形分离空塔，底部为玻璃砂过滤介质，高径比为2:1，采用框架式搅拌，输送管自上而下插入，与固定化孢子培养器相连。输送管直径为10毫米，玻璃砂规格为G3，孔径为15-30微米
示例1
本实施例用于说明通过封闭式光生物反应器培养雨生红球藻的方法。
在该实施例中，游泳细胞培养装置和固定孢子培养装置都是封闭的光生物反应器。
(1)雨生红球藻的原代培养
将雨生红球藻接种到装有1000mL BG11培养基的2000mL三角瓶中，接种后培养液的OD680值为0.015。在20-22℃，1800-2200Lux，pH 6-7，培养藻液至OD值为0.3。在培养过程中，用高纯度二氧化碳调节pH值。
(2)雨生红球藻在封闭式光生物反应器中游泳细胞阶段的培养:在封闭式光生物反应器中消毒后，加入28L BG11培养基和第一阶段培养的雨生红球藻种，培养液的初始OD680值为0.08。混合气体通过气石分散以气泡形式从密闭光生物反应器底部进入，搅拌混合，进气流速200 L/h，培养温度20-24℃，光照强度1800-5000Lux，pH值6-8，pH值由混合气体进气流量控制。
(3)雨生红球藻游泳细胞的分离和转移:培养7天后，培养液的OD680值达到0.3，将8.4L雨生红球藻液体从步骤(2)的密闭光生物反应器中通过溢流转移至分离、储存和运输装置中。经玻璃砂过滤后，得到分离后的清液I和雨生红球藻游动细胞，分离后的清液I进入培养基罐与补充培养基混合，并泵入步骤(2)的封闭式光生物反应器中，使封闭式光生物反应器中的培养基体积达到28L，继续培养雨生红球藻游动细胞。8.4L液体从清液罐泵入分离储存装置，与过滤得到的雨生红球藻游动细胞混合。混合均匀后，抽真空空，混合溶液通过输送管进入固定化孢子培养装置。
(4)清洗分离储运装置:real 空转移后，加入去离子水清洗分离储运装置至中性，清洗液进入清液槽备用。
(5)雨生红球藻的固定化孢子以及油和虾青素的积累在两个平行的固定化孢子培养器即封闭的光生物反应器中进行:将混合溶液转移到第一个封闭的光生物反应器后，向每升混合藻类溶液中加入0.02mol的碳酸氢钠以进行固定化孢子转化以及油和虾青素的积累。培养温度28-32℃，光照强度5000-15000Lux，pH值7-9。混合气体通过气石分散，以气泡形式从封闭式光生物反应器底部进入，搅拌混合。混合气体的进气量为60L/h，pH值由混合气体的进气流量控制。
培养10天后，在光学显微镜下观察，不动孢子由外围向中心变红，停止进气，静置分离，得到分离的清液II和雨生红球藻不动孢子。分离出的清液II进入清液罐，雨生红球藻固定化孢子进入浓缩罐，经旋风喷雾干燥后得到雨生红球藻粉。
当步骤(3)中用于雨生红球藻游动细胞阶段培养的封闭式光生物反应器中的培养液的OD680值达到0.3时，重复步骤(3)，将混合液转移至第二固定孢子培养器，即第二封闭式光生物反应器。依次循环。
根据雨生红球藻游泳细胞培养阶段的培养液的总体积，雨生红球藻的培养速率为3g/m2/d，并且获得的雨生红球藻中的油含量和虾青素含量分别为36%和1.5%。
示例2
该实施例用于说明通过使用开放式光生物反应器培养雨生红球藻的方法。
在该实施例中，游泳细胞培养装置和固定孢子培养装置都是开放式光生物反应器。
(1)雨生红球藻的原代培养
将雨生红球藻接种到装有1000mL BG11培养基的2000mL三角瓶中，接种后培养液的OD680值为0.015。在20-22℃，1800-2200Lux，pH 6-7，培养藻液至OD值为0.3。在培养过程中，用高纯度二氧化碳调节pH值。
(2)雨生红球藻的游泳细胞期培养在开放式光生物反应器中进行:在开放式光生物反应器中加入16L BG11培养基和一级培养的雨生红球藻种，培养液的初始OD680值为0.03。混合气体通过气石分散以鼓泡的形式进入光生物反应器，搅拌混合，入口流速为80l/h。培养温度为22-25℃，光照强度为1800-5000Lux，pH值为6-8，pH值由混合气体的入口流量控制。
