根据您的问题，答案是：大客车长途半夜两点到早上五点不能行驶。
国家运营部有关行车安全规定如下：
(一）加强道路通行秩序管理。公安部门要加强客运车辆道路通行秩序管理，严格查处客运车辆超员、超速行驶、疲劳驾驶等交通违法行为。
（二）严格夜间通行管理。交通运输部门要严格客运线路审批，对夜间途经达不到夜间安全通行条件的三级（含）以下山区公路，不得批准客运班线。严格执行长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行规定，公安部门在道路执法中发现客运班线夜间行车的要禁止通行，并及时通报交通运输部门，由交通运输部门督促客运企业合理调整客运班线的发车时间。
（三）防止疲劳驾驶。客运车辆每日运行里程超过400公里（高速公路直达客运超过600公里）的，客运企业应当配备两名以上驾驶员。驾驶员连续驾驶不得超过4小时，或者24小时内累计驾驶不得超过8小时。客运企业要制定更加严格的防止疲劳驾驶措施，创造条件安排长途驾驶员落地休息。
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法律分析】
大巴车凌晨2点至5点在高速上必须休息。根据《道路旅客运输企业安全管理规范》：长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
【法律依据】
《道路旅客运输企业安全管理规范》长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
