酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，则也可单独激活报告基因的表达。因此，为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同，这可减少大量的假阳性。另外，报告基因通常整合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：
（1）这种相互作用是否会在细胞内自然发生，即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
（2）某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。
（3）一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体（motif）如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来，酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进，并且已取得较好的效果〔2，3〕。
在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来〔4〕。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题，但也应予以重视。
转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时，共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中，通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。
目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法〔5〕。
酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i 典型的真核生长转录因子, 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)前者可识别DNA上的特异序列, 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游, 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用, 启动它所调节的基因的转录 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开, 仍具有各自的功能而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体上述二类载体在构建融合基因时, 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合融合基因在报告株中表达, 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenc [利用酵母双杂交筛选基因] 利用酵母双杂交筛选基因 e), 而GAL4-ad没有因此, 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞最常用的是酵母细胞, 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd, LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad, VP16)激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中, 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ), 从而可分析蛋白间的结合作用 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用, 具有高度敏感性主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行, 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强, 后者又与启动子DNA结合, 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大 同时, 酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生假阳性结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少假阳性的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白间的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因（常用lacZ和HIS3）有以下优势vii：⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因， 可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力， 尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统Ⅷ也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用， 得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段。
以上就是关于酵母双杂交的常见问题全部的内容，包括:酵母双杂交的常见问题、酵母双杂交可用于报道基因的种类有哪些产物有哪些、酵母双杂交的局限性等相关内容解答，如果想了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！
