革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884
年由丹麦医师gr
二创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用g＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用g
一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95
％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成g
＋和g
一两大类群，常用的复染液是番红。
操作步骤
1、涂片
将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l
一2
次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2、染色
(
1
）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
(
2
）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
(
3
）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95
％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20
一30
秒钟，立即用水冲净酒精。
(
4
）复染用番红液染1
一2
分钟，水洗。
(
5
）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
(
6
)
同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
注意事项
1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
实验流程
1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用马克笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、涂片
液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5厘米左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2毫米左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2－3次固定（以不烫手为宜）。
5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1分钟。
6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。
7、媒染：滴加1滴碘液，染1分钟，水洗。
8、脱色：吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20－30秒至流出液无紫色，立即水洗。
9、复染：滴加蕃红复染3－5分钟，水洗。至此，革兰氏染色结束。
G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。
常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。
大肠杆菌的形态是杆状的，经革兰氏染色菌体颜色变成红色，说明大肠杆菌是革兰氏阴性（G-）细菌。
金**葡萄球菌的形态是球状的，经革兰氏染色菌体颜色变成蓝紫色，说明金**葡萄球菌是革兰氏阳性（G+）细菌。
革兰氏染色法之所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是因为一般认为革兰氏染色是基于细菌细胞壁特殊化学组分进行染色的。
扩展资料
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
（1）涂片固定。
（2）草酸铵结晶紫染1分钟。
（3）蒸馏水冲洗。
（4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。
（5）水洗，用吸水纸吸去水分。
（6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
（7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，蒸馏水冲洗，干燥，镜检。
参考资料来源：百度百科--革兰氏染色
参考资料来源：百度百科--革兰氏染色法
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