大巴车凌晨2点至5点在高速上必须休息。根据《道路旅客运输企业安全管理规范》：长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
【法律依据】
《道路旅客运输企业安全管理规范》长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
驾驶长途客车，请注意停车休息。24小时累计驾驶时间不超过8小时，白天连续驾驶不超过4小时，夜间连续驾驶不超过2小时，每次停车休息时间不少于20分钟，驾驶客车请保持安全车速，夜间行驶要减速慢行，最高时速不超过白天正常限速的80%。
夜间行车注意事项
夜间道路上的交通流量小，行人和自行车的干扰也相对较少，驾驶员一般比较容易高速行车，因而很可能发生交通事故。
夜间行车由亮处到暗处时，眼睛有一个适应过程，因此必须降低车速，在驶经弯道、坡路、桥梁、窄路和不易看清的地方更应降低车速并随时做好制动或停车的准备；驶经繁华街道时，由于霓虹灯以及其他灯光的照射对驾驶员的视线有影响，这时也须低速行驶。
按相关规定长途客运车辆在凌晨2点到5点是禁止在高速上行驶的，这个时间段一定要记住，不然开车到高速路口就驾驶不上去了。
对小车等其它车辆目前并没有明确禁行上高速时间的相关政策，但禁止长途客运车辆在凌晨2点到5点在高速上行驶，主要是为了安全起见。这是因为在这个时间段已经到了深夜，属于夜间行车，司机们不免会有疲倦。在这段时间禁止大巴车上高速，可以防止因为疲劳驾驶导致交通事故，司机们也可以好好利用这个时间休息。
即使有明文规定了长途客运车辆在凌晨2点到5点禁止在高速上行驶，驾驶人们在平时的驾驶中也要注意休息，避免长时间驾驶。
根据您的问题，答案是：大客车长途半夜两点到早上五点不能行驶。
国家运营部有关行车安全规定如下：
(一）加强道路通行秩序管理。公安部门要加强客运车辆道路通行秩序管理，严格查处客运车辆超员、超速行驶、疲劳驾驶等交通违法行为。
（二）严格夜间通行管理。交通运输部门要严格客运线路审批，对夜间途经达不到夜间安全通行条件的三级（含）以下山区公路，不得批准客运班线。严格执行长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行规定，公安部门在道路执法中发现客运班线夜间行车的要禁止通行，并及时通报交通运输部门，由交通运输部门督促客运企业合理调整客运班线的发车时间。
（三）防止疲劳驾驶。客运车辆每日运行里程超过400公里（高速公路直达客运超过600公里）的，客运企业应当配备两名以上驾驶员。驾驶员连续驾驶不得超过4小时，或者24小时内累计驾驶不得超过8小时。客运企业要制定更加严格的防止疲劳驾驶措施，创造条件安排长途驾驶员落地休息。
