高速公路上大巴车凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输。
《国务院关于加强道路交通安全工作的意见》第二条第五项规定：
严格长途客运和旅游客运安全管理。
严格客运班线审批和监管，加强班线途经道路的安全适应性评估，合理确定营运线路、车型和时段，严格控制1000公里以上的跨省长途客运班线和夜间运行时间，对现有的长途客运班线进行清理整顿，整改不合格的坚决停止运营。
创造条件积极推行长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输。客运车辆夜间行驶速度不得超过日间限速的80%，并严禁夜间通行达不到安全通行条件的三级以下山区公路。夜间遇暴雨、浓雾等影响安全视距的恶劣天气时，可以采取临时管理措施，暂停客运车辆运行。
加强旅游包车安全管理，根据运行里程严格按规定配备包车驾驶人，逐步推行包车业务网上申请和办理制度，严禁发放空白旅游包车牌证。
运输企业要积极创造条件，严格落实长途客运驾驶人停车换人、落地休息制度，确保客运驾驶人24小时累计驾驶时间原则上不超过8小时，日间连续驾驶不超过4小时，夜间连续驾驶不超过2小时，每次停车休息时间不少于20分钟。
有关部门要加强监督检查，对违反规定超时、超速驾驶的驾驶人及相关企业依法严格处罚。
扩展资料
《国家安全生产监督管理总局关于进一步加强和改进道路客运安全工作的通知》第五条规定：
（一）加强道路通行秩序管理。公安部门要加强客运车辆道路通行秩序管理，严格查处客运车辆超员、超速行驶、疲劳驾驶等交通违法行为。
（二）严格夜间通行管理。交通运输部门要严格客运线路审批，对夜间途经达不到夜间安全通行条件的三级（含）以下山区公路，不得批准客运班线。公安部门在道路执法中发现客运班线夜间途经达不到夜间安全通行条件的三级及以下山区公路的，要禁止通行，并及时通报交通运输部门，由交通运输部门督促客运企业合理调整客运班线的发车时间。
参考资料来源：中国政府网-国务院关于加强道路交通安全工作的意见
【法律分析】大巴车凌晨2点至5点在高速上必须休息。根据《道路旅客运输企业安全管理规范》：长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
【法律依据】
《道路旅客运输企业安全管理规范》长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
