先把载体切了，剩下的就好办了。T克隆的原理是基于常规PCR反应中所使用Taq聚合酶能够在PCR产物的3‘末端非特异性添加一个A,这样实际上常规PCR产物都含有3端突出一个A的黏性末端.基于这个原理,常规的线性T－克隆载体（PUC18和PUC19等）在其3’末端添加一个T,这样的载体能够和任何PCR产物进行连接克隆,并不需要添加任何特异性的黏性末端位点.这个就是T克隆的原理了.
关键是这个黏性末端带的是什么。因为t载体的末端是突出的t。如果直接是pcr产物，需要考虑，用taq酶扩增的片段可以直接连，如果是高保真酶扩增的片段，需要用taq酶加a尾，大约30min左右。如果是已经经过酶切的片段，确实要补平加a。
用限制性内切酶制备T载体陆哲明,柯 杨△[北京大学临床肿瘤学院(北京市肿瘤防治研究所)遗传室,北京 100034]
[关键词]T载体DNA限制酶类遗传载体基因扩增[摘 要]
目的:介绍一种制备T载体的方法。方法:用限制性内切酶XcmⅠ酶切,在两端产生T末端,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。结果:PCR产物直接和T载体连接,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化,对转化子提取质粒进行酶切鉴定,证明阳性率达80%。结论:制备T载体过程简单,质量稳定,产量高,并可扩增等优点。
[中图分类号]Q342[文献标识码]A[文章编号]1671 167X(2002)06 0726 03
PCR是目前体外DNA扩增最常用的方法,对PCR产物进行快速有效的克隆是开展下游许多实验所要求的。目前TA克隆是一种快速的,一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的方法。而商品化的TA克隆系统由于售价高,质量批次间不稳定且无法进行循环使用等缺点,在实际应用中,限制了T载体的广泛使用。本文介绍了一种简单、高效,可在普通实验室中制备并可反复扩增的T载体制备方法,并经PCR产物克隆,酶切鉴定,得到了非常理想的结果。
1 材料与方法1
.1 制备SuperpGEM Teasy载体(简称pSP Teasy载体)1
.1.1 制备pSP Teasy环化载体 以线性化的pGEM Teasy载体(Promega为模板,两边设计引物:
F:GAATAAGCTTGTTCCCAGGTCAAGACTGGATCACTAGT
HindⅢXcmⅠG
AATTCGCG
R:GAACAAGCTTATTCCCAGTCTAGACCTGGATCGAATTC
HindⅢXcmⅠC
CGCGGCCGCCA
引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位点,3′端与模板互补,在PfuDNA聚合酶的作用下扩增,扩增产物经HindⅢ酶切后,自身环化,挑选能被HindⅢ酶切的克隆即为阳性克隆,经测序进一步证实。
1.1.2 制备pSP Teasy线性化载体 按照标准酶切体系,用XcmⅠ(NEB)酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,玻璃奶回收,测量吸光度值(D260),调整质量浓度至50mg·L-1,此载体可直接用于克隆。
3 讨论PCR技术是目前体外扩增DNA最常用的方法。有时需得到克隆化的DNA以便于杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。定向克隆需在引物5′端引入限制性内切酶位点,PCR产物经适当内切酶酶切后产生粘端,连接到相应载体。非定向克隆有两种策略,一种是平末端克隆,在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR产物末端,但连接效率仅为粘端连接的1/50,且自身环化率高[1]另一种是TA克隆。TA克隆是一种快速的,一步到位的非定向克隆法,可以把PCR产物直接插入到质粒载体。TA克隆系统利用TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性,在扩增DNA3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸,通常为腺苷酸[2]。这个3′A突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′T突出端的载体。制备好的载体,其关键部分是带有3′T突出端的线性分子。目前制备3′T载体的方法是先用平末端限制性内切酶(如EcoRⅤ)酶切载体,再用TaqDNA聚合酶在仅有dTTP的情况下,72～75℃反应,在3′末端添加一个T[1,3]。但是,实际反应过程中,由于3′末端加T为非优先聚合核苷酸,仅部分的3′端可添加T,或者有少量可能添加一个以上T,造成载体在克隆过程中自身环化高,必然增加筛选阳性克隆的难度。另外,每次生产T载体产量有限(一般为1μg),不适于大规模生产,造成批次间质量差异大。即使商品化TA克隆试剂盒也存在阳性率低和质量不稳定的缺点。因其价格昂贵,并且无法进行循环使用,在普及上存在一定困难。利用限制性内切酶制备T载体利用限制性内切酶特异性强,一次酶切产量高,质量稳定,易于操作等特点。在内切酶家族中,有一类称可变酶,它们的识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的,如本文采用的XcmⅠ,它识别序列见图3a,在构建pSP Teasy载体时,利用其中间序列可变,在靠近T7启动子端,设计了XcmⅠ的识别序列见图3b,而在靠近SP6启动子端XcmⅠ的识别序列见图3c,这样在XcmⅠ酶切后,其剩余的序列如图1,在3′端分别产生T。经查NewEnglandBiolabs公司的目录,符合上述特征的酶列于表1。
我们在两个XcmⅠ之间引入HindⅢ位点有下列优点:(1)在构建pSP Teasy时提供方便(2)经HindⅢ酶切后,可以防止载体中的XcmⅠ位点不完全酶切造成的自身环化(3)两个XcmⅠ位点之间,提供保护的碱基,便于XcmⅠ酶切。用于克隆的PCR产物在连接前需经琼脂糖凝胶电泳,如条带锐利,则一般无需纯化即可直接用于连接如产物有非特异扩增或引物二聚体浓度较高,最好先用低熔点胶或玻璃奶法纯化。如果扩增用具有保真功能的聚合酶,如PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶或TliDNA聚合酶,由于它们有3′～5′的外切酶活性,则PCR产物为平末端,需经纯化后用TaqDNA聚合酶在dATP存在下72℃加腺苷酸尾15～30min,即可达到相同效果。插入片段(PCR产物)与载体摩尔比一般要求在3∶1～1∶3之间,但按笔者经验,摩尔比不经优化亦可产生较好克隆效果,可能与pSP Teasy在原理上无法自身环化有关。pSP T是在Promega公司pGEM Teasy载体基础上构建而成的,它具有原载体的优点[4]:(1)用T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶可正反两方向体外转录RNA(2)载体克隆位置的两侧各有EcoRⅠ、NotⅠ和BstZⅠ等酶切位点,便于用单一酶切鉴定(3)T7、SP6和M13等通用序列,便于测序。新的pSP Teasy不仅保留原载体所有的优点外,还具有(1)末端加有T的载体含量高,因为以往所加T为合成反应添加,不能保证每个末端均有T。而用内切酶法,利用其特异性识别酶切位点的特点,并经HindⅢ处理XcmⅠ酶切不完全的载体,则在原理上保证自身无法环化且均能产生T末端(2)由于采用内切酶法,保证了质量的稳定性(3)产量大,每次可产生10～20μg,而经典方法仅1～5μg(4)方法简单,成本低廉,适合普通实验室制备。只需一步酶切,纯化后即制备完毕,步骤简单且耗时少。而传统方法需经酶切,纯化,加T,再纯化等步骤(5)环化T载体可以扩增后循环使用。以上特有优点保证了克隆效果稳定,阳性率高。
(a)CCANNNNN NNNNTGGGGTNNNN▲NNNNNACC
(b)CCAGGTCT AGACTGGGGTCCAGATCTGACC
(c)CCAGGTCA AGACTGGGGTCCAG▲TTCTGACC
(a)RecognitionsiteofXcmⅠ
(b)5′ endrecognitionsiteofXcmⅠ
(c)3′ endrecognitionsiteofXcmⅠ.
图3 在不同部位XcmⅠ识别序列Figure3 RecognitionsequenceofXcmⅠatdifferentsite
