SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。
因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。
使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。
所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。
首先是反转录合成 cDNA 第一链：
实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。
若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。
将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。
若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。
cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。
本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。
本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。
按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 设备中。
双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。
在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。
点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。
设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。
设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。
点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。
Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。
在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。
样品编辑好后，可进行实验结果分析。
点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。
点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。
点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。
Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。
扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。
在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。
按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。
rtpcr和实时荧光定量pcr区别就是过程不同，具体如下：
RT-PCR一般情况下是指反转录PCR。
基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。
实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR，Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
PCR原理：
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
所谓实时荧光定量PCR技术 ，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
检测方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）
2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
服务流程
1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；
2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；
3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；
4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；
5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；
6.正式定量实验：对所有样品上机检测；
7.实验结果和数据分析，形成报告。
收费标准
优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）
（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数
（如图1所示）。
1. 荧光阈值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光 。 1．传统定量PCR方法简介
1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标对定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。 各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。
