trizol 法提RNA怎样去多糖

我本科毕业论文做的是SSH，需要提大量RNA，也碰到了

多糖

问题。其实trizol法提取总RNA很好，简单又节约时间，但是对于

植物材料

貌似不是很理想。当初我们改进了方法，用CTAB提取RNA的，然后增加了一步去多糖（提完RNA后）用025倍体积的

无水乙醇

和低

浓度

的盐将多糖沉淀，同时使RNA留在

溶液

中。然后再用异丙醇将RNA沉淀出来。其实当初我们参考了很多文献，貌似LiCl过夜沉淀RNA去除多糖效果比较理想的，只是耗时，你可以试一下。想当初，我们也是反复实验的。以上仅供你参考。。。如果想知道CTAB具体的方法，可以站内消息联系。另外，TAKARA公司有一种专门提取富含多糖组织中RNA的

试剂

，你也可以试一下。

（仅供参考）1ml就可以了，细胞的RNA提取比较容易，只要你提取过程能够保证不污染，RNA一般不会降解，质量也应该不错。如果要使浓度高一点，你可以稀释的时候少加点DEPC水，我不知道你是多少水稀释的，可以减少一下。

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；

3 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加02ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加05ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

实验一：细胞中总RNA的提取及鉴定

一、目的：

掌握Trizol提取总RNA的原理和步骤，学习电泳鉴定总RNA的方法。

二、原理：

RNA是核酸，具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。

常用的试剂为Trizol，该试剂可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 51左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。

判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。

三、步骤：

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