甘油管保藏的菌种如何复壮

我说一下我的步骤吧

先将保存的菌种取出,快速解冻,再接种LB液体培养基37度,摇床培养过夜取培养液划线接种于LBA,分出单菌落挑取平板上的单菌落接种于LB液体培养基培养至对数生长期作为发酵用的菌种

PS：如果是工程菌是带抗性选择标记的,培养基中需加它所耐受的抗生素

菌种退化是客观规律，退化的菌种很难恢复原状。

（1）退化原因

退化菌种的菌丝在培养基上表现生长很慢，长势弱，稀疏，伸入培养基深层无力，分泌色素差；出耳慢，中途停止发育，子实体形态不一致，大小、厚薄不均，颜色改变，产量低。菌种退化原因主要有以下几方面：

①基因变异。遗传特性的表现是基因与环境因子共同作用的结果。当基因往性状差的方向发生变异时，即使环境条件适宜，也必然造成种性退化。

②无限继代。制种技术和条件上的差别，只作组织分离、不作出耳鉴定，无限继代、无限制地转管，这些做法都加速了菌种的退化。

③营养不良。长期使用单一种类和配方、成分基本相同的培养基，造成营养不能达到生理要求，菌丝生长活力由强变弱，衰老退化。

④环境欠佳。菌丝生长发育期环境不良，杂菌污染，也会加速菌种退化。

（2）防止措施

根据菌种衰老退化的原因，要针对性地采取以下措施：

①减少扩接。菌种的退化、种性变异，是在繁殖过程中发生的，可采用控制菌种移接次数来防止。当获得优良菌种后，严格控制转管次数。生产中应减少菌种扩接次数。

②防止突变。采用0～4℃低温保藏菌种，有条件时在液氮超低温条件下保藏。

③分离复壮。优质菌种，需要经常复壮。每次生产出耳后，应挑选优良子实体，进行组织分离。每年进行一次孢子分离，经出耳鉴定后，选择性状优良的再进行组织分离。总之，有性孢子分离与无性组织分离要交替使用。用有性繁殖来发现好的变异菌株，用组织分离来巩固这些优良菌株的遗传特性。复壮的措施很多，诸如更换培养基、创造适宜环境、防止杂菌污染及避免多品种混合栽培等。

真菌（以酵母为例）当然也存在复壮问题。一株酵母菌在多次繁殖后，会产生老化现象。需要复壮。老化现象一般表现是对数生长期不明显，曲线过于平缓；菌密度下降明显；稳定期短；产物产生量下降等。

酵母菌的复壮其实也是分离纯化培养，只是要把遗传性状稳定、生长良好的菌挑选出来。一般不用秋水仙素等，因为这类物质很容易造成菌种不可逆变异，导致菌种无法继续使用。

复壮的步骤一般是这样的。

将菌种在全营养培养基中液体培养，进入对数生长期后（时间不要太长，否则会繁殖过度），做较大批量的稀释平板。观察菌落生长情况，挑选生长优势菌落（长得快、长得大），检测其某方面的生理功能，如发酵力、产酸、产酶等。此过程重复进行，综合考虑生长优势与生理功能优势，直到得到生长强壮、生理功能满意的菌株。

一般一次复壮会多挑选几支进行对比选择，也会多留下几支，以备不时之需。

因为菌种保存久了，会自发的产生变异，自发突变对微生物来说很常见，发生变异后，微生物的特性就会改变，变成不是我们想要的特性。但是，在保存的菌种中，发生突变的微生物不可能是全部，总有一部分微生物还是原来的特性，所以复壮就是要把这些未变化的微生物再次筛选出来，再进行纯化、保存。筛选的标准是原保存菌种的特性。

菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境

要明白菌种活化的情况就需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃ 冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。

对于不同的保存方式活化的方式也不同：

1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；

2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；

3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；

4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热， 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；

5 -80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养

6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

总结一下菌种活化需要以下几个步骤：

第一配置菌种适宜生长的培养基

第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻

第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮

第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落

经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的

希望对你有帮助！

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