大巴车凌晨2点至5点在高速上必须休息。根据《道路旅客运输企业安全管理规范》：长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
【法律依据】
《道路旅客运输企业安全管理规范》长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输，凌晨2点后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车就近引导到服务区或客运站停车休息。从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
夜间在道路上（高速公路、混合道路）行驶的客运车辆凌晨2点至5点必须就近停靠在安全地带，落地休息，驾驶员要及时提醒车上旅客不要随意走动，照看好随身携带的物品，如有需求及时联系驾驶员等。
《中华人民共和国道路交通安全法》 第二条 中华人民共和国境内的车辆驾驶人、行人、乘车人以及与道路交通活动有关的单位和个人，都应当遵守本法。
扩展资料：
1、严格客运班线审批和监管，加强班线途经道路的安全适应性评估。
2、合理确定营运线路、车型和时段，严格控制1000公里以上的跨省长途客运班线和夜间运行时间，对现有的长途客运班线进行清理整顿，整改不合格的坚决停止运营。
3、创造条件积极推行长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输。
4、客运车辆夜间行驶速度不得超过日间限速的80%，并严禁夜间通行达不到安全通行条件的三级以下山区公路。
5、夜间遇暴雨、浓雾等影响安全视距的恶劣天气时，可以采取临时管理措施，暂停客运车辆运行。
省公安厅要求，全省交警部门要确保足够警力上路执勤，坚决落实7座以上客车逢车必查措施，对超员载客的要一律卸客转运，决不允许超载超速，坚决落实出站、出城、上高速、过境等关口的检查措施。尤其要加强对长途客运车辆安全管理措施，强制实行长途客车凌晨2点至5点休息制度，凌晨2点以后禁止长途客车从收费站口上高速，对此时间段内正在高速公路上行驶的长途客车 就近引导到服务区或客运站停车休息。
