1、大客车不能在高速公路上行驶的时间是凌晨两点至五点。根据相关法律规定，夜间在道路上行驶的客运车辆凌晨2点至5点必须就近停靠在安全地带。此时驾驶员要及时提醒车上旅客不要随意走动。
2、法律依据：《道路旅客运输企业安全管理规范》
第三十八条 客运企业在制定运输计划时应当严格遵守客运驾驶员驾驶时间和休息时间等规定：
（一）日间连续驾驶时间不得超过4小时，夜间连续驾驶时间不得超过2小时，每次停车休息时间应不少于20分钟；
（二）在24小时内累计驾驶时间不得超过8小时；
（三）任意连续7日内累计驾驶时间不得超过44小时，期间有效落地休息；
（四）禁止在夜间驾驶客运车辆通行达不到安全通行条件的三级及以下山区公路；
（五）长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输；从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。
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【法律分析】高速公路上大巴车，在凌晨两点之五点禁止在高速路通行。高速公路属于高等级公路。中国交通部《公路工程技术标准》规定，高速公路指：能适应年平均昼夜小客车交通量为25000辆以上、专供汽车分道高速行驶、并全部控制出入的公路。
【法律依据】
《中华人民共和国公路工程技术标准》 第一条 大巴车夜间行驶：1、必须按规定随车配备两名或以上具备资质的、经考核合格的驾驶员；2、大巴车驾驶员在夜间2时至5时之间运营时，必须在公司规定的休息点停车换人；3、在休息点待班的驾驶员要保证有充分休息的时间，并保证在每天夜班接班前有不低于6小时的强制卧床休息时间；每班车执行驾驶员落地换人时；下车休息的随车驾驶员不得低于1人，另一名未下车的随车驾驶员不得立即驾驶大巴车，必须由新换上车的驾驶员驾驶；4、大巴车在交接班期间，要提前做好旅客安全告知和其他相关服务工作，确保旅客人身和财产安全；下车休息的驾驶员必须在交班后1小时内强制卧床休息，与第二次轮换上车的的间隔时间不得低于8小时；5、夜间22时至次日凌晨6时之间，驾驶员连续驾驶时间不得超过2小时，每次停车休息时间不得少于25分钟；夜间行车速度必须保证在日间限速的80%以内；高速公路最高速度不得超过80公里/小时。
宁波到舟山最晚的一班大巴是22:00（晚上10点）宁波汽车站到舟山班车信息：(1)宁波汽车南站→舟山定海客运站大巴发车时刻：每天发车时间为6:15~22:00。全天每小时大约有3至4班车，但是中午12点到13点和晚上8点以后，车次较少。
