培养基灭菌方法

将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。

2.干热灭菌

将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170℃加热1～2h可达到灭菌的目的。能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。

3.高压蒸汽灭菌

将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，继续加热使锅内的气压逐步上升，温度也随之升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，维持15~30

min。

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料.由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等.另外,培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压.

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质,是应用最广的凝固剂.加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化,于45℃以下凝固.但多次反复融化,其凝固性降低.

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌,以备纯培养用.一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌.

3材料

3.1器皿及材料

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱.

3.2药品试剂

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液.

4流程

称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板.

5步骤

5.1培养基的制备

5.1.1称量药品

根据培养基配方依次准确称取各种药品,放入适当大小的烧杯中,琼脂不要加入.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.

5.1.2溶解

用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中,在放有石棉网的电炉上小火加热,并用玻棒搅拌,以防液体溢出.待各种药品完全溶解后,停止加热,补足水分.如果配方中有淀粉,则先将淀粉用少量冷水调成糊状,并在火上加热搅拌,然后加足水分及其它原料,待完全溶化后,补足水分.

5.1.3调节pH

根据培养基对pH的要求,用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH.测定pH可用pH试纸或酸度计等.

5.1.4溶化琼脂

固体或半固体培养基须加入一定量琼脂.琼脂加入后,置电炉上一面搅拌一面加热,直至琼脂完全融化后才能停止搅拌,并补足水分(水需预热).注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦.

5.1.5过滤分装

先将过滤装置安装好（图3-1）.如果是液体培养基,玻璃漏斗中放一层滤纸,如果是固体或半固体培养基,则需在漏斗中放多层纱布,或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤.过滤后立即进行分装.分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口,以免浸湿棉塞, 引起污染.液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜.固体分装装量为管高的1/5,半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶,其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜.

5.1.6包扎标记

培养基分装后加好棉塞或试管帽,再包上一层防潮纸,用棉绳系好.在包装纸上标明培养基名称,制备组别和姓名、日期等.

5.1.7灭菌

上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌.普通培养基为121℃20min,以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份.培养基经灭菌后,如需要作斜面固体培养基,则灭菌后立即摆放成斜面(图3-2),斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后,垂直冷凝成半固体深层琼脂.

5.1.8倒平板

将需倒平板的培养基,于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板.

5.2灭菌方法

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类.本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌.

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种.通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的.蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力.

5.2.1.高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法.这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的.当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15～30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢.一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）.

5.2.1.1操作方法和注意事项如下

加水

打开灭菌锅盖,向锅内加水到水位线.立式消毒锅最好用已煮开过的水,以便减少水垢在锅内的积存.注意水要加够,防止灭菌过程中干锅.

装料、加盖

灭菌材料放好后,关闭灭菌器盖,采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋,使蒸汽锅密闭,勿使漏气.

排气

打开排气口(也叫放气阀).用电炉加热,待水煮沸后,水蒸气和空气一起从排气孔排出,当有大量蒸汽排出时,维持5min,使锅内冷空气完全排净.

升压、保压和降压

当锅内冷空气排净时,即可关闭排气阀,压力开始上升.当压力上升至所需压力时,控制电压以维持恒温,并开始计算灭菌时间,待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃,20min）后,停止加热,待压力降至接近“0”时,打开放气阀.注意不能过早过急地排气,否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外.

灭菌后的培养基空白培养

灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养,经24h培养无菌生长,可保存备用；斜面培养基取出后,立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后,空白培养.

5.2.2干热灭菌法

通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌.一般是把待灭菌的物品包装就绪后,放入电烘箱中烘烤,即加热至160～170℃维持1～2h.

干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌.凡带有胶皮的物品,液体及固体培养基等都不能用此法灭菌.

5.2.2.1灭菌前的准备

玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌.

5.2.2.2干燥箱灭菌

将包扎好的物品放入干燥烘箱内,注意不要摆放太密,以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触.将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h,注意勿使温度过高,超过170℃,器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧.如果是为了烤干玻璃器皿,温度为120℃持续30分钟即可.温度降至60～70℃时方可打开箱门,取出物品,否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂.

用此法灭菌时,绝不能用油、蜡纸包扎物品.

5.2.2.3火焰灭菌

直接用火焰灼烧灭菌,迅速彻底.对于接种环,接种针或其它金属用具,可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌.此外,在接种过程中,试管或三角瓶口,也采用通过火焰而达到灭菌的目的.

料袋打穴封口后，进入灭菌环节。灭菌的目的是将培养基内的所有有害微生物全部杀灭，保证银耳菌种顺利地定植生长。银耳栽培量较大，其料袋多采用常压蒸汽灭菌，灭菌时注意掌握以下关键技术：

（1）及时进灶

培养料灭菌前，大量微生物存在，培养料调水后加速增殖，分解基质，导致酸败。因此，装料后要立即进灶灭菌。通常要求的时限是装袋后2小时内进灶结束。

（2）合理叠袋

培养基进灶的叠袋方式，应采取一行接一行，自下而上重叠排放，上下袋形成直线；前后叠的中间要留空间，使气流自下而上畅通，蒸汽能均匀运行，防止互压缝隙。如果是采用大型罩膜灭菌灶，一次容量3000～5000袋，其叠袋方式可采取四面转角处横直交叉重叠，中间与内腹直线重叠，上层倾斜内向，防止倒塌。但内面要留一定的空间，让气流正常运行。叠好袋后罩紧薄膜，外加帆布或麻袋，然后用绳索缚扎于灶台的钢钩上，四周捆牢，上面加物重压，以防蒸汽冲力把罩物冲飞。

（3）掌握温标

袋进蒸灶后，立即旺火猛攻，使温度在5小时内迅速上升到100℃，这叫“上马温”（即从点火到100℃）。如果在5小时内未能达标，容易导致一些高温杂菌繁衍，使养分受到破坏，造成基料变质。达到温度100℃后，中小型灶，持续14～18小时中途不停火，不掺冷水，不降温。使之持续灭菌，防止出现“大头、小尾、中间松”的现象。大型罩膜灭菌灶由于气体膨胀，膜内上温较快，从点火至100℃不到2小时。但因容量大，所以上升到100℃后，应保持20～22小时，才能达到彻底灭菌之目的。

（4）认真观察

在灭菌过程中，工作人员要坚守岗位，随时观察温度、水位和是否漏气。砖砌水泥专用灭菌灶的蒸仓正面上方，设有温度观察口，应随时用棒形温度计插入口内，观察温度。如果温度不足，应加大火力，确保持续不降温。锅台边安装1个水位观察口：如锅内有水，热水从口中流出；若从口处喷水蒸气，表明锅水已干，应及时补充热水，防止烧焦。砖砌灭菌灶由于蒸仓膛壁吸热，所以上温较慢，一般从点火到100℃需5小时。灭菌时应先排除蒸仓内的冷气，让大气从仓顶排气口排出，1～2小时后再把排气口堵塞，并用湿麻袋或泥土、石头压住；同时检查仓壁四周是否出现漏气，如有漏气应及时用湿棉花塞住缝隙，杜绝漏气，以免影响灭菌效果。

（5）避胀防破

达到灭菌要求后，转入卸袋工序。卸袋前先把蒸仓门板螺丝旋松，把门扇稍向外拉，形成缝隙，让蒸汽徐徐逸出。如果一下打开门板，仓内热气喷出，外界冷气冲入，一些装料太松或薄膜质量差的料袋，突然受冷热冲击往往膨胀成气球状，重者破裂，轻者冷却后皱纹密布，故需待仓内温度降至60℃以下时，方可趁热卸袋。卸袋时，应套上棉纱手套以防蒸汽烫伤，如发现袋头扎口松散或袋面出现裂痕，随手用纱线扎牢袋头，胶布贴封裂口。卸下的袋子用板车或拖拉机运进冷却室内。上面遮薄膜，防止刺破料袋和雨水淋浇。