一、革兰氏染色法
不少于两种染料参与的染色方法称之为复染法，革兰氏染色法属于复染法类的一种染色方法。由结晶紫、碘液、番红参与，通过染料对细菌的细胞壁的着色，来区分革兰氏阴性菌与阳性菌的一种方法。
二、主要步骤及关键步骤
（1）制片。
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
（2）初染。
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
（3）媒染。
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
（4）脱色。
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20-30s。
（5）复染。
用番红液复染约2min，水洗。
（6）镜检。
干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
扩展资料：
革兰氏染色的原理
结晶紫（C25H30ClN3）当中的CL-与I-发生氧化还原反应生成不溶于水的蓝紫色复合物（C25H30lN3）。
革兰氏阳性菌细胞壁较厚且肽聚糖网层次多而交联致密，进行脱色时，因失水反而使网孔缩小，再加上结构中不含类脂，所以脱色处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内。
而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过脱色处理后后仍呈无色状态，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
参考资料来源：百度百科——革兰氏染色法
革兰氏染色原理是通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌遇乙醇或丙酮脱色处理时，不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌在遇脱色剂后，呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。其中，染色的差异主要是阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。
细菌细胞的革兰氏染色的结果与细菌细胞壁的肽聚糖层的厚薄、类脂质含量有关。经染色后根据颜色加以区分。
革兰氏阳性细菌的细胞壁肽聚糖壁厚、类脂质含量低，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
革兰氏染色法的原理：
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
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