什么是转录组分析

转录组

是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间

和空间

的限定，是连接

基因组

遗传信息与生物功能的

蛋白质组

的必然纽带。转录水平的调控是

目前

研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。

应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。mRNA的转录本表达分析，通过获得研究对象基因组转录区域的信息，鉴定转录发生

位点

，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。

随着测序技术的蓬勃发展、测序成本一再下降，转录组测序分析已然成为生物学及医学研究最最不可或缺的必备技术手段。

但是,对于大多数初学者来说,偶尔也还是会给你带来一些小困扰，为节省宝贵的时间，我给大家特此整理了一些常见问题或者分析经验，供大家参考~

1、Q:样本聚类和相关性可以通过什么方式得到呢？

A:使用样本的fpkm值，默认通过最长距离法（complete），计算样本间的欧氏距离，计算模式为斯皮尔曼相关系数（spearman），得到样本间的相关性打分，和聚类结果。相关性结果可以通过热图展示。

2、Q:表现趋势相同的一组样本为何会聚类不好？

A:组内样本存在个体差异，此差异影响整体基因表达差异较大（噪音基因存在），建议查看差异基因聚类情况，若良好可让步处理。

3、Q:聚类良好的分组，为何比较组间差异基因较少？

A:样本间差异很小，实验处理没有导致较大的基因表达水平差异；默认差异基因筛选条件较为严格，此类情况可适当放松筛选阈值（如调参[15,005,005]）。

4、Q:剔除离群样本后，聚类为何依然并不理想？

A:样本聚类为整体基因（所有样本所有基因）参与计算，剔除的样本的基因表达不再参与计算，整体的聚类情况会有一定变动，多数情况下聚类可向预期方向改善，但不保证实际聚类与预期完全一致。

1、Q:影响组间比较得到的差异表达基因数目的因素有哪些？差异表达基因数目太少怎么办？

A:比较组的差异表达基因的数目的影响因素主要有以下2个方面：

比较组内和比较组之间的样本相关性。 正常情况下，组内样本相关性要高于组间样本的相关性；若出现组间部分样本相关性较高的异常情况，组间样本整体基因表达模式相近，则组间的差异表达基因的数目则会降低。

差异基因筛选的参数设定。 差异基因筛选主要参考差异倍数（Fold change 值）以及 q值（padj 值，矫正之后的Pvalue值）作为相关指标，通常选取|log2 Fold change|≥1和q<005的差异基因作为显著差异基因。

差异表达基因数目太少，则可以通过2个方面进行调整：

2、Q:有100多个差异基因，为何GO或KEGG无富集结果呢？

A:虽然差异分析后筛选到了差异基因，但是得到的基因集较为“分散”，各条目/通路都未能富集到较多基因（未达显著富集判断标准），因此无显著富集结果。

建议可以试着关注下差异基因涉及的通路、功能，是否和研究课题相关，或者尝试其他的功能富集方法。

后续，我们会定期推出各类产品分析常见的问题，请大家拭目以待！

转录组测序最快10个自然日可以拿到报告。转录组广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，快速转录组仅需12个自然日（12天=建库+测序+分析周期），而安诺可以7天完成转录测序，使快速转录组10个自然日完成。

基因课FTP地址： ftp://>

以DNA为模板合成RNA的转录过程是基因表达的第一步，也是基因表达调控的关键环节。所谓基因表达，是指基因携带的遗传信息转变为可辨别的表型的整个过程。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。通过测序技术揭示造成差异的情况，已是目前最常用的手段。人类基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转录成mRNA分子，转录后的mRNA能被翻译生成蛋白质的也只占整个转录组的40%左右。通常，同一种组织表达几乎相同的一套基因以区别于其他组织，如：脑组织或心肌组织等分别只表达全部基因中不同的30%而显示出组织的特异性。

转录组谱可以提供什么条件下什么基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。例如：阿尔茨海默病(Alzheimer′s diseases, AD)中，出现神经原纤维缠结的大脑神经细胞基因表达谱就有别于正常神经元，当病理形态学尚未出现纤维缠结时，这种表达谱的差异即可以作为分子标志直接对该病进行诊断。同样对那些临床表现不明显或者缺乏诊断金标准的疾病也具有诊断意义，如自闭症。对自闭症的诊断要靠长达十多个小时的临床评估才能做出判断。基础研究证实自闭症不是由单一基因引起，而很可能是由一组不稳定的基因造成的一种多基因病变，通过比对正常人群和患者的转录组差异，筛选出与疾病相关的具有诊断意义的特异性表达差异，一旦这种特异的差异表达谱被建立，就可以用于自闭症的诊断，以便能更早地，甚至可以在出现自闭症临床表现之前就对疾病进行诊断，并及早开始干预治疗。转录组的研究应用于临床的的另一个例子是可以将表面上看似相同的病症分为多个亚型，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应等等。

用于转录组数据获得和分析的方法主要有基于杂交技术的芯片技术包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，基于序列分析的基因表达系列分析SAGE （serial analysis of gene expression，SAGE）和大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)。

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广义： 转录组 （transcriptome）是特定细胞在某一功能状态下转录本的总和。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的，具有特定的空间性和时间性。

狭义：转录组是指直接参与蛋白质的mRNA的总和

mRNA：编码基因

tRNA:携带氨基酸到核糖体上进行蛋白质的合成

rRNA:与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物“合成”的装配机

micro RNA/mi RNA :调控基因表达

snoRNA(核仁小RNA)：参与rRNA成熟加工

snRNA(核内小分子RNA)：参与mRNA的剪接

gRNA(引导RNA)：参与RNA编辑

SRP-RNA（信号识别颗粒）参与蛋白质分泌

dsRNA(双链RNA)：基因沉默

IncRNA长链非编码RNA：表达调控

······

分子杂交 ：RT-PCR（Real Timeq PCR）通过对经典PCR扩增反应中的每个循环产物荧光信号的实时检测，我们可以实现对模板的定量分析，通过正确设定引物（primer）和探针（probe）,qRT-PCR技术可以很大范围内定量检测目标转录本的拷贝数，即表达水平。

EST （Expressed sequence tags）：表达序列标签。是指从不同组织来源的cDNA序列，通过对一个随机选择的cDNA克隆进行单次测序来获得cDNA的部分序列，只要测序到一个基因的EST片段，就能证明这个基因是有表达的。EST是基于测序的，并不需要事先知道待检测转录本的序列。

基因表达的连续分析技术 （Serial Analysis of Gene Expression,SAGE）能同时对上千个转录本进行研究。

SAGE技术的主要依据有两个：

（1）一个9~10碱基的短核苷酸序列标签包含足够的信息，足以特异性的确定某一种转录本。

（2）如果将短片段标签相互连接，集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式输入计算机中进行处理，这样就可以对数以千计的mRNA转录本进行分析，这个和DGE技术有些类似。

基因芯片（genechip） 也叫微阵列（ microarray）通过将几十万个不等的探针（probe）分子固定在约1厘米见方的固体片基上制成。利用核苷酸分子在形成双链时碱基互补配对的原理，微阵列可以一次性检测出样本中所有与探针互补的核苷酸片段，从而快速得到样本中基因的表达谱（expression profile）

缺陷：只能检测已知物种的转录表达情况，无法检测芯片中不包含的序列，并且不容易定量。

数字基因表达谱DGE （Digital Gene Expression Profiling）DGE利用新一代高通量测序技术和高性能计算分析技术，能够全面、经济、快速的检测到某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况。

缺陷： 基于序列标签进行测序，只能适用于真核生物，不适合原核生物。

以上技术缺陷：

第一： 需要依赖已知参考序列，如果没有一直序列，就无法捕获。

第二：通量低，一次不能捕获全部的转录情况

第三：只能定性，不能定量，只能确定有无，不能确定多少。只能确定一个基因是否表达，不能确定表达量的多少。

第四： 不适合所有物种

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