如何构建一个基因的过表达载体

当拿到一个基因的DNA片段后，就需要把它导入一个载体，一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。

常用的载体有细菌质粒，噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。所谓载就是一个很长的环状DNA，携带一些基因，可以导入细菌中自我复制，也可以从细菌中提取出来改造。

现在我们就需要把SUN片段连到一个载体，用VectorNTI打开，研究一下用哪个酶处理，这个载体需要用Sma1这个酶切开，然后用SUN连上，替换切下来的ccdb，这里要用到两个酶，一个Sma1限制性内切酶切开，一个DNA连接酶把新片段连上，植物转基因载体和这些酶都是非常常用的试剂。

载体构建好之后需要把它们导入大肠杆菌中复制，这里就要用到大肠杆菌的感受态了，十把构建好的载体和感受态混合，然后放到42度热水处理个1分钟，再冰上放个3分钟。

这时需要一些培养细菌的培养基来培养菌们，大肠杆菌这种菌很好养活，唯一需要注意的是，灭菌过后的培养基要小心保存。把在冰上处理过的大肠杆菌放到培养基中培养一天，为了防止没有转入载体的菌也混进来，我们在载体上加入了一个抵抗抗生素的基因。

这样我们在培养基中加入这种抗生素，在里面就只有需要的大肠杆菌能生长了。最后得到了上亿个携带着含有我们的SUN基因的载体的大肠杆菌，这时就需要把质粒再提出来。

实验室里提质粒需要用专门的试剂盒，也可以简化一下，先把菌液离心让菌沉淀，然后再用水把菌打散，然后煮沸1分钟再离心，取上清，上清中加乙醇让DNA析出，再离心让DNA沉淀，最后用水把DNA溶解。这样提出来的DNA会有很多杂质以及细菌的基因组DNA。

扩展资料：

目的基因与运载体结合：

将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，

要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处。

首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来。

形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

参考资料来源：百度百科-基因表达载体

基因表达的原理：基因的选择性表达

通过在细胞核中对DNA进行转录得到mRNA

然后mRNA通过细胞核的核孔离开细胞核进入细胞质

接着核糖体附着在mRNA开始翻译

tRNA携带着氨基酸按照遗传信息将氨基酸连接成肽链

在经过内质网和高尔基体的处理最终形成成品的蛋白质

RNA的作用相当与信息传递者

因为蛋白质的合成不能直接以DNA为模板

但是可以以mRNA作为模板翻译出肽链最终形成蛋白质

常用的过表达质粒载体有以下几种：

1 pET系统：适用于大规模表达，常用于大肠杆菌中，具有高表达水平和高纯度的特点。

2 pGEX系统：适用于表达融合蛋白，常用于大肠杆菌中，具有高表达水平和易于纯化的特点。

3 pMAL系统：适用于表达融合蛋白，常用于大肠杆菌中，具有高表达水平和易于纯化的特点。

4 pT7系统：适用于表达外源蛋白，常用于大肠杆菌中，具

问题一：什么是基因的“过表达” 如果是买的典盐的话，一般在菜七八成熟的时候放最好了，因为里面的好多对人体有利的养分一般在这个温度下就开始溶解到菜里了，而且使盐的味道也溶到里了，这样的话，做菜的味道也是最棒的

细细品味吧

问题二：我想使目的基因过表达，实验应该如何进行？最好详细地讲一下步骤，多谢了！ 楼主的问题问的太宽泛了。请问你是具体问题出在哪里呢？

你可以利用Biomart这个工具（），找到种间的orthlogue关系以及各种类型的注释ID直接的对应关系。你也可以用ncbi里面的homologene数据库去找种间的同源序列

multiple alignment可以用clust W或者mega做。

系统发育树可以用mega做。PHYLIP好像也可以。

基因结构上可以做做gc含量，外显子大小，splicing，调控序列什么的

蛋白结构预测软件很多，不过我没做过。

ncbi有一个conserved domain 的数据库，你可以和他比较下，分析下结构域。

表达情况。。。。你可以找找相关的EST（ncbi）或者array（。。这个不记得了俯在ncbi上应该有别人的数据）的表达数据。

问题三：什么是基因的“过表达”？ 简明扼要的说就是，本来基因表达鼎受到各种内外信号的精确调控的，一旦这种调控机制的任何一个环节出现问题就会失控。基因的表达过程就可能进入失控状态，就有可能表现为表达过度，即该基因被过度的转录、翻译，最终基因表达产物超过正常水平。

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