（一）概述：NGS测序在病原微生物检测中的应用

微生物在地球上无处不在，从陆地到海洋，从衣物到皮肤，甚至我们的身体内部。

繁衍、变异、自然选择和生存斗争，是所有生物必须经历的。

因为生命的第一要义，是生存。

为了生存，必须斗争，生物之间为了争夺资源，以及生物与自然环境之间，都存在着斗争 ，在这个过程中，有些微生物能够与人类和平共处，甚至互利共生，而有的微生物则会使人患病，通常有细菌、真菌、病毒、支原体，以及衣原体，这些就是临床上的病原微生物。

自然选择需要经历漫长的过程，但是近年来环境污染，药物滥用，加快了病原微生物的进化速度，耐药菌，超级菌的出现，严重威胁着人类健康。

还有一些微生物，本来与人类没有交集，原先只存在于自然界，而有人为了猎奇，食用野生动物，从而把这些动物身上携带的病毒带到了人类社会，如本世纪初的非典病毒（Severe Acute Respiratory Syndromes, SARS）就是例子，这类新型病毒对公共卫生健康形成了巨大的挑战，个别人的贪婪，给全世界的人们带来了巨大的灾难。

当健康受到了威胁，对付细菌，人类发明了抗生素， 对付病毒，发明了抗病毒药物，但要如何治疗，第一步是找出元凶，而这在临床上往往存在困难。

传统的血常规，或者器官和组织的影像学指标能够判断感染的可能性，但并不能作为确诊的依据，比如血常规只能告诉你是否有细菌或病毒感染，但不能告诉你是什么细菌或病毒，还需要进一步检查才能确诊，以便对症下药。

实验室检查，如抗原检测、核酸检测、代谢产物检测以及毒素检测才是明确感染、指导治疗和判断预后的重要手段。

为了克服传统方法的不足，下一代测序技术（Next-generation sequencing technology，NGS）在病原微生物检测中的应用具有非常大的优势，如：

当然，NGS的缺点也是有的：

即便有不足，但NGS的技术优势更为明显，在疑难微生物，以及难以培养甚至无法分离培养的少见菌属的鉴定，特别是新型病原微生物的暴发流行监测方面，NGS快速、准确和高分辨率的特点，使其成为病毒鉴定的金标准，在流行病学分型中发挥着重要作用。

新型冠状病毒（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）正肆虐全球，目前尚无疫苗和特效药，人们除了戴口罩，注意个人卫生以及增加社交距离外别无他法，面对汹涌的疫情，再一次提醒人类，要放下自己是万物之灵的傲慢，因为微生物才是当之无愧的地球之王，它们在这个星球上生存的历史比人类更长，种类和数量也比人类要多得多。

我们不能，也不应该试图消灭所有微生物。我们之间的关系，不只有对抗，还有合作，但是当我们的健康受到威胁时，也要勇于斗争。

物竞天择，适者生存，人类与微生物的合作与斗争，必将永远进行下去。

人体的浆膜腔有胸膜腔、心包腔、腹膜腔、关节腔、阴囊鞘膜腔等。在正常情况下，腔内仅有少量液体，起滑润作用。但在病理情况下，腔内可有大量积液，称为浆膜腔积液，如胸腔积液、腹水、心包积液、阴囊鞘膜积液、关节腔积液等。由于积液病因不同，可分为漏出液与渗出液两种，其各种成分和性质明显不同，检查各种积液的量、外观、酸碱度、相对密度、蛋白、葡萄糖及显微镜检查等，意义在于区别积液的性质，判明是漏出液，还是渗出液，然后找出病因，进行诊疗。

1)、胸腔积液中的细胞数　①红细胞：红细胞数在0005×10^12/L(05万/mm3)以下时，无临床意义，001×10^12/L(1万/mm3)以上有意义。肉眼血性胸腔积液则示恶性肿瘤、外伤性血气胸、肺梗塞、胸膜结核等。血性胸腔积液中的红细胞比积(Ht)为末梢血的50%以上。　②白细胞：中性粒细胞增加，则表示从肺实质到胸腔的急性炎症发展为脓胸。小淋巴细胞占50%以上时示恶性肿瘤或结核。寄生虫性或真菌性胸膜炎、或血气胸的后遗症、嗜酸性粒细胞增加，其原因不明。　③间皮细胞：间皮细胞通常占胸腔积液中的细胞数5%以上，但结核性胸膜炎常在1%以下。　(2)、胸腔积液的细菌学检查：　近年，脓胸的病因菌厌氧性菌增加，革兰阳性球菌为金**葡萄球菌、链球菌。革兰阴性杆菌为绿脓杆菌、大肠杆菌。结核性胸膜炎时结核杆菌培养阳性约为25%。　(3)、胸腔积液的生化学检查：　①比重：比重1018、蛋白为30g/L(30g/dl)有助于漏出液与渗出液的鉴别。　②蛋白：是漏出液与渗出液鉴别的必要检查，但是蛋白与疾病无相关性。胸腔积液的蛋白分型与血清相同，分子量小的白蛋白相对增加，胸腔积液的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)，比血清值低无诊断意义，肺并殖吸虫病(肺吸虫病)的胸腔积液IgE值比血清高其诊断价值大。　③葡萄糖：胸腔积液中的葡萄糖浓度，与血清的葡萄糖浓度平行变 动，胸水中的葡萄糖浓度低于333mmol/L(60mg/dl)，见于结核、癌性胸膜炎、风湿性关节炎、肺炎并发胸膜炎等。系统性红斑狼疮(SLE)胸腔积液中的葡萄糖浓度在正常范围，对鉴别风湿性关节炎有意义。　④乳酸脱氢酶(LDH)：是漏出液与渗出液鉴别的必要检查，一般胸膜的炎症程度与胸腔积液的LDH值平行。渗出性胸腔积液的疾病的LDH同工酶，通常4型和5型值高，癌性胸膜炎约1/3为2型值高。　⑤淀粉酶：胸腔积液中淀粉酶浓度在超出血清值的正常极限时多见于胰腺炎、癌性胸膜炎、食道破裂3种疾病。　⑥pH值：胸腔积液的pH<720时多见于肺炎并发胸膜炎、食道破裂、风湿性关节炎、结核性胸膜炎、癌性胸膜炎、血胸、系统性红斑狼疮等。　⑦腺苷脱氨酶(ADA)：结核性胸膜炎的辅助诊断检查，ADA>50U/L则多为结核，溶血的癌性胸腔积液中也出现高值，必须鉴别。　⑧胸腔积液中甘油三酯：中性脂肪升高大于452mmmol/L,而胆固醇含正常可见乳糜胸。　(4)、癌细胞检查：诊断癌性胸膜炎必须检查的项目，癌细胞诊断阳性率30-70%，阴性也不完全否认癌性胸腔积液。

1985年，美国人凯利·穆利斯开创了聚合酶链式反应，也就是PCR，用来快速富集DNA。这一天才idea从诞生之日，便改变了整个分子生物学的发展进程。“设计引物→提取核酸→上机扩增→跑胶”，成了众多生物科研狗的日常。分子生物学甚至因此被称之为“凝胶上的科学”。

基于PCR开发的技术，包括RT-PCR、ddPCR、光PCR等等，正在全世界无数的实验室帮助科研人员理解、挖掘分子层面的生物学奥秘。比如目前最常用7500，无论是高校、医院、第三方检测机构，基本都用得到它。

花开两朵，各表一枝，测序技术的发展要比PCR坎坷很多。

NGS，即Next Generation Sequencing，下一代测序技术，又称二代测序，高通量测序，鉴于基因测序发展过程复杂，我简单分为几个阶段，并不严谨，望各位海涵。

第一阶段 天降猛男

提起测序，不得不提测序行业的鼻祖，天降猛男---弗雷德里克·桑格，测定第一条蛋白质序列和第一条基因序列，并因此两获诺奖的男人。

第二阶段 通量为王

2005年，生命科学公司推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，即454焦磷酸测序, 开创了第二代测序技术的先河。

ABI和Illumina也不甘落后，相继推出各自的高通量测序仪。第二代测序技术成为了近十几年来，科研中最常用的测序技术，越来越多物种的全基因组图谱被绘制，各种GWAS研究，千人基因组计划，TCGA计划，极大的推动了生物学对临床的指导意义。

从花费十年耗资30亿美元的人类基因组计划，到如今基因组测序成本降至千元以下，这十余年的发展不可谓不迅猛。测了这么久的全基因组，学术界的主要矛盾也逐渐发生了改变。大家发现，NGS虽然好，但是烧钱啊，再测下去教授的裤衩都没了。为了几篇nature，science，把家底都赔上好像也不是很划算。有没有那种通量高、价钱低、对临床还有价值的技术啊？

第三阶段 剑指临床

经历过第二阶段的洗礼后，课题组的教授们学聪明了，不烧钱了，也没钱可烧了。大家开始心有灵犀的搞靶向测序，甚至还有白嫖的（数据挖掘）。

这第三阶段的，我以2013年为分水岭，因为这一年罗氏关闭了454测序业务，454焦磷酸测序仪逐步退出市场。

同样在2013年，Illumina收购了Verinata Health 、Advanced Liquid Logic、NextBio三家公司。这三家公司专注的技术领域分别为繁殖和遗传健康、微流样品处理以及基因组信息学。

经此一年，Illumina完成了产业链的整合，以测序仪生产为核心，并将触手伸向下游的测序数据分析服务。

旧王已死，新王当立。

到2016年，Illumina已垄断全球测序仪器市场超过70%，而当年欲收购Illumina的罗氏，仅占市场10%的份额。

因为Illumina深知测序只是开始，最终，他们面对的是一个更加广阔的检测市场，客户想要的不是简简单单ATCG的排列组合就完事了，而是具有临床意义的遗传风险、用药指导、甚至是液体活检。

低测序深度WGS数据无对照样本，检测新生儿染色体异常工具

产前检测，传统使用绒毛膜绒毛或羊水取样，进行核型分析。但是取样会造成约1%的流产概率。

研究表明，约34%~62%的胎儿cfDNA会出现在母亲的血浆中，且在整个基因组中呈现均一分布。这些片段已经足够用于检测胎儿的染色体异常。

目前使用NGS进行产前检测的一个缺陷是，每次在检测一组新的数据时需要配套检测健康的参考样本，以减少实验造成的影响，提高了检测成本。

本文介绍的这个工具开发了一种新的检测手段，通过样本内部的染色体片段频率的自我比较，解决实验上的浮动，从而可以实现，在低测序深度03fold，且无健康对照的情况下稳定可靠的染色体异常检测。

构建参考bins 需要一组正常的样本，来确立每一个bin对应哪些参考bin集合；

使用z-score计算，测试样本每个bin，相对于该样本自身的参考bin区域的read 频率差异——individual bin method；

使用滑动窗口范围内的所有单个bin z-score联合计算 Stouffer’s z-score —— sliding window method

z-score的计算公式

是测试样本第i个bin的偏离分值， 是测试样本bin i 中的read 频率， 是bin i在对应参考bin中的均值和标准差。当z-score ，该bin 被标注为潜在异常。

为提高灵敏度，当确认一个bin为异常时 ，该bin 被存在列表L中，然后重新计算所有bin的z-score（参考bin 移除L 中的bin） 。重复这一过程直到L 不变或达到设定次数。

为了移除过多的相邻检出，允许合并检出的区域，中间隔几个bin（gap），称为 MaxBinSkip （文章使用 2个bin）；此外，为了删除由几个碰巧彼此接近的峰值产生的检出，我们对发现的畸变bin的最小数量设置一个阈值MinLength（10 bins）。

individual bin method 灵敏度较低且易受峰值影响；

使用 Stouffer’s z-score 计算target bin附近的bins的z-score。

是在（silding window ）bin i 上的z-score，考虑的是bin i 左方v 个bins 和右方的v 个bins。

当 时判断为异常：

是使用sliding window 方式计算出的bin i 的状态。

当存在无法检测的bin 在sliding window 时，忽略这些点，所以减少了window 中bin 的数量。该方法同样使用MaxBinSkip 和 MinLength 。文章中使用的sliding window 大小为 11 个bins（每个bin 1M）。

非整倍体突变的检测也是基于亚染色体检测的结果。当出现非整倍体变异时，该染色体上几乎所有的bin都会被标注为异常bin。一般会用一个阈值T作为判断标准。

是染色体c 判断的结果， 是染色体c上所有可以用于检测的bin的数量，T是用户自己设定的阈值（本文05）。

假设母亲血浆样本中胎儿的DNA的含量是~5%，则应该能够检测到至少5%的读频差异来检测出一个染色体区域的拷贝数变化。

这里引入一个AvgASD（average allowed deviation over all bins）概念，每个tagert bin，计算其参考bin集合的reads 频率标准差，并除以target bin的reads 频率，得到了一个reads频率的最小相对变化值。当所有Tagrt bin 中这些值平均AvgASD > 005，结果就会被认为不太可靠，因为此时要检测出来变异需要超过5%的reads频率变化。

高AvgASD 与reads 覆盖度无关但是会带来大量假阳性结果尤其19号染色体，GC-normalization可以显著降低AvgASD。

文章取56名孕妇的血浆，并假设胎儿DNA占5%。使用hiseq2000 51bp单端测序，全基因组覆盖02~07 层，被测试的样本包含8个21三体、2个13三体、2个18三体、2个22三体和4例存在亚染色体缺失或dup。使用核型分析作为正确判断标准。测序结果使用mismatch1 拆分数据，map 基因组时不允许mismatch，超过一个map位置的reads会被丢弃。

为了除去部分异常高深度的reads，用一个特制的过滤方法，去除大量重叠reads的所有reads，只保留第一个read。bin大小 1Mb, 500kb,250kb and 100kb都分别做了测试。其中1Mb的结果比较稳定，更小的bin szie会引入噪音和大的差异。GC-normalization是用Biopythons LOWESS function on the GC-count and read depth per bin 所有的步骤，都省略了性染色体，因为比对到X和Y上的reads数量和婴儿的性别强相关。

对于WISECONDOR来说，19号染色体的检测比较困难，很可能因为GC含量比较高，比较难找到参考bin。

WISECONDOR基于的假设是，样本的基因组大部分区域都是正常的，所以当大部分基因都有变异时就无法正确工作，比如三倍体。

参考文献：

Straver R, Sistermans EA, Holstege H, Visser A, Oudejans CBM, Reinders MJT WISECONDOR: detection of fetal aberrations from shallow sequencing maternal plasma based on a within-sample comparison scheme Nucleic Acids Res 2014;42:e31

美国第三代试管婴儿的NGS基因测序技术是新一代的PGS基因筛查技术的升级技术，整体来说，NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，使麦沃海外试管婴儿专家可以在短时间内对基因进行精确定位，对于临床诊断和保障麦沃试管成功率起到事半功倍的作用。

NGS基因测序技术需要7~14天的时间才能出具检查报告，所以选择此项技术的前提是选择冻胚移植(即将培育出的囊胚进行冷冻处理，待到NGS检查结果出来后再进行囊胚移植)；新一代测序技术NGS会给患者带来一个更准确的检查结果，试管婴儿成功率亦会得到更大程度地提升。

以上就是关于（一）概述：NGS测序在病原微生物检测中的应用全部的内容，包括:（一）概述：NGS测序在病原微生物检测中的应用、什么是胸水NGSS检查、【临检杂谈】---临床检测，到底该选PCR还是NGS(一)等相关内容解答，如果想了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！