E.coliDNA连接酶和T4连接酶的区别

1、作用不同

E.coliDNA 连接酶是生物体内重要的酶，其所催化的反应在DNA 的复制和修复过程中起着重要的作用。

T4-DNA连接酶即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。

2、连接条件不同

用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；

用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；

先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。

扩展资料：

粘性末端DNA片段的连接

DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。

平末端DNA片段的连接

常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。

同聚物加尾法

这种方法的核心部分是，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。

由核酸外切酶处理过的DNA，以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称之为poly（dA）尾巴。

反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly（dT）尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。

这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法（homopolymertail-joining），简称同聚物加尾法。

衔接物连接法

所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。

接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。

DNA接头连接法

DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。

实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。

参考资料来源：百度百科-DNA连接酶

参考资料来源：百度百科-T4DNA连接酶

参考资料来源：百度百科-T4-DNA连接酶

T4DNA连接酶作用机制：分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA 连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA。

T4DNA连接酶连接要求和结果 外源DNA末端性质 连接要求 连接结果 不对称粘性末端 两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。 对称性粘性末端 线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。 平端 要求高浓度的DNA和连接酶 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。

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