疫苗使用的原则?

1990年，Woiff等人首次证实体外合成的mRNA肌肉注射到小鼠体内后产生活性蛋白。这是mRNA疫苗的原型。

然而，mRNA本身稳定性差，在体内易被核酸酶降解，是制约其发展的瓶颈。因此，mRNA疫苗需要一种合适的运送载体将其运送到体内，才能有更好的免疫效果。开发高效无毒的递送系统是mRNA疫苗成功的关键。

盛辉之前总结过上述RNA药物的要点(点击查看瓶颈)。本文将重点分析mRNA疫苗的递送，需要解决哪些问题？

问题1:与DNA疫苗相比，mRNA疫苗不需要进入细胞核，没有整合到基因组的风险，相对更安全。MRNA疫苗可作为预防疫苗预防流感等传染病，也可作为治疗疫苗治疗癌症等重大疾病。

目前，mRNA疫苗主要包括非复制型mRNA和病毒来源的mRNA(自我扩增mRNA (SAM，图1)。

图非复制型mRNA(A)和病毒来源的自我扩增型mRNA(SAM)(B)的结构组成(来源:J Int Pharm Res，第46卷，第5期，2019年5月)

非复制型mRNA通过体外转录技术合成，与真核mRNA的分子结构一致，主要由5 # 39；非翻译区，UTR)，开放阅读框，ORF)，3 # 39；非翻译区，5 # 39；帽状结构(Cap)和100-250bp的聚腺苷酸尾。5#39;——UTR和3 # 39；UTR中的调节元件可以稳定mRNA并增加抗原蛋白的翻译。ORF是编码抗原的核酸序列，Cap能以正确的方向翻译mRNA。Poly (A)可以增加mRNA的稳定性和抗原蛋白的表达，抗原蛋白在mRNA的翻译和稳定中起重要作用，可以通过Poly (A)聚合酶加到mRNA上。一般mRNA的合成是以含有目的蛋白ORF的质粒为模板，体外转录合成，最后加入5 # 39；和第3 # 39；末端聚(A)。体外合成的mRNA进入细胞后，在核糖体上翻译形成功能蛋白。

病毒衍生自扩增mRNA(SAM)是将编码抗原的核酸序列直接插入到单链RNA病毒(如塞姆利基森林病毒、黄热病毒等)中。)，通常分子量比较大，能表达大量抗原。目前，大多数SAM疫苗都是基于甲病毒基因组，其中编码mRNA复制机制的基因是完整的，但编码结构蛋白的基因被目标基因取代，这可以通过使用DNA模板的体外转录技术很容易地获得。

MRNA递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。慢病毒、腺相关病毒、仙台病毒等病毒载体虽然可以传递核酸，但可能会受到载体引起的免疫反应的限制，影响其应用。

非病毒载体主要包括脂质体、树突状细胞(DC)、无机纳米颗粒、阳离子穿膜肽等。其中，脂质体在递送mRNA方面具有独特的优势:1)脂质体为球形囊泡，能包裹mRNA，抵抗核酸酶的作用；2)脂质体类似细胞膜，易与受体细胞融合，转染效率高；3)脂质体能传递mRNA不同大小的碎片；4)脂质体作为递送载体不受宿主限制。到目前为止，脂质载体已经成为传递mRNA最有效的非病毒载体。用于递送mRNA的常用脂质体材料如表1所示。

(资料来源:J Int Pharm Res，第46卷，第5期，2019年5月)

目前，在用于递送mRNA的非病毒载体中，脂质体应用最为广泛，主要包括脂质体复合物(LP)、脂质体聚合物(LPR)、脂质体纳米粒(LNP)、阳离子纳米乳(CNE)等。

最早的脂质体递送材料是阳离子脂质体。带正电荷的阳离子脂质体和带负电荷的mRNA通过静电作用聚集形成多层胶囊复合物，称为脂复合物(LP)。复合物中包封的mRNA不容易被RNase降解，可以成功地传递给细胞翻译的功能蛋白。2-二油酰基羟丙基-3-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)被证明是有效的递送载体。

阳离子聚合物可以浓缩mRNA，mRNA和聚合物浓缩后被阳离子脂质体包裹在囊状空腔内，形成脂质体聚合物(LPR)。LPR首先用于DNA转染，后来也用于siRNA和mRNA转染。

脂质体LNP一般由被脂质双层壳包围的水性核心组成，脂质双层壳由不同的脂质组成，每种脂质发挥不同的作用。LNP是目前主流的快递公司之一。然而，早期阳离子LNP在体内的应用仍然受到很大限制，如容易被巨噬细胞清除，产生有害的活性氧簇ROS。

为了解决这些问题，提出了“可电离”LNP的概念。虽然极大地促进了核酸药物的发展，但仍不尽如人意。纳米粒的体积比较大，一般需要静脉注射，只能有效进入肝、脾、肿瘤等具有较大空间隙的组织。另外，LNP的过敏反应也比较严重，注射前要用抗组胺药和激素类药物控制。这些缺点使得LNP药物只适用于罕见疾病和癌症等严重疾病。

Brito等人使用阳离子纳米乳剂(CNE)递送不同种类的SAM疫苗。CNE配方基于诺华专利佐剂MF59。与LNP相比，CNE已用于临床试验，具有更重要的临床意义。

即使许多药物(如生化药物抗癌和抗真菌药物、基因药物、麻醉剂)已经通过脂质体给药并取得成功，但由于脂质体的一些缺点，如易氧化降解、制备和繁殖率差、难以大规模工业化生产等，仍有一些问题需要解决。同时，由于传统脂质纳米粒的开发进展缓慢，目前开发的有效递送载体非常有限。

然而，递送载体只是待解决的难题之一，与之正相关的药物递送机制也不清楚。

问题2:给药方式mRNA疫苗的给药方式非常重要，它将决定mRNA疫苗在体内的代谢以及靶抗原蛋白翻译的效率。比如直接静脉注射未经任何处理的裸mRNA，会被血液中的核酸酶快速降解。

mRNA的给药可分为全身给药或局部给药，取决于抗原蛋白需要表达的位置(下图为全身给药和局部给药)。如果是预防性疫苗，为了诱导强烈的免疫反应，通常通过皮下和肌肉注射局部给药。如果是治疗性mRNA疫苗，通常通过腹腔或静脉注射系统给药。

图:全身给药和局部给药(来源:用于mRNA递送的生物材料)

同时，对于mRNA的脂质体递送，不同的给药途径对诱导的蛋白表达、给药频率和副作用的强度有重要影响。例如，LNP递送可以通过改变给药途径来改变体内mRNA表达的量和持续时间，其中肌内注射和皮内注射显示出比静脉注射更持久的蛋白质表达。

研究表明，脂质体的给药方式主要有五种。

1)静脉注射。药物通过血液流经全身，迅速发挥药效的全身给药方式，也是脂质体传递mRNA常用的给药方式。静脉注射后，脂质体首先被富含网状内皮细胞的组织(肝和脾)摄取，然后被单核细胞和巨噬细胞吞噬，少量被肺和骨髓摄取。由于脂质体进入血液的大小和电荷不同，它们在血液中的清除率也不同。较大脂质体的清除速率比较小脂质体快。静脉注射不可避免的缺点是，如果脂质体制备过程中产生的毒性溶剂残留，会比其他给药方式对身体产生更多的副作用。

2)皮下注射。这是常规疫苗接种第二常用的给药方式。皮下注射是在皮肤和骨骼肌之间输送mRNA，可以直接将mRNA转染到淋巴结中的DC。但是，皮下注射有一定的剂量限制。如果剂量太大，需要分点注射，操作难度大。

3)肌肉注射。mRNA被输送到肌肉组织中。这种给药方式的优点是容易实现大剂量给药，但对粒径和电荷有特殊要求。较大的粒径和电荷会减少输送并影响药物疗效。

4)皮内注射。脂质体可以在表皮和真皮之间直接递送。表皮和真皮之间有大量免疫细胞(朗格汉斯细胞，DC亚型)。皮内注射可有效诱导Th1(辅助性T细胞1)型免疫应答。但它和皮下注射有同样的缺点，不能实现大剂量给药，需要点注射或多次给药才能达到所需的治疗剂量。

5)转染5)DC细胞。另一种非常重要的施用mRNA的方式是通过转染DC细胞，这可以分为两种方式:体内和体外由DC细胞介导。DC细胞是人体内重要的抗原提呈细胞，摄入抗原后可诱导后续免疫反应。体外分离人未成熟DC细胞后，通过电穿孔转染mRNA，然后将转染的DC细胞导入人体产生被动免疫。

然而，体外DC转染递送mRNA疫苗需要非常高的技术要求，需要长时间的体外培养，首先需要获得人DC细胞，这在普通条件下很难实现。通过DC细胞给药的另一种方式是淋巴内给药，其中mRNA被直接注射到淋巴中，以便通过淋巴中固有的DC细胞获得mRNA。然而，这种给药方式通常需要手术辅助，这导致了复杂的给药和大量的风险。

综上所述，以上五种给药方式都是常用的疫苗给药方式，但各有利弊。使用哪种给药方式要看具体情况。

目前受限于递送效率，只有少数(0.01%)的mRNA分子能够成功进入细胞质并表达蛋白质，因此大剂量给药仍是常态，这会带来很大的副作用。只有选择合适的给药方式，脂质体才能更好地递送mRNA，以更小的剂量和更少的副作用激发更大的免疫效果。

问题3:专利护城河在世界范围内，还没有基于mRNA技术平台的治疗或预防药物或疫苗被批准上市。国外有“mRNA疫苗研发三巨头”:Moderna、CureVac、BioNTech，均采用脂质纳米技术递送(LNP)，这也是目前核酸药物领域广泛使用的递送技术类型。

其中，Moderna专注于mRNA药物的研发。这家公司成立于2010年；2011年正式投入运营；2018年上市，创造了美股历史上最大的生物科技公司IPO纪录。但是，技术和专利本身的问题让Moderna走在了前列。

核心争议是Moderna的核心技术及其专利保护能力。

首先，这是mRNA药物最关键的递送问题。Moderna原本使用的脂质体技术，会激活强烈的炎症反应和肝毒性(尤其是反复注射)，直接导致早期产品线的失败。

Moderna声称在后续产品中使用了自己的新脂质体输送技术。然而，第一个质疑的声音来自于杨梅——杨梅怀疑Moderna在至少两个领先产品中非法使用了杨梅的LNP交付技术，随后杨梅提起了一场关于Moderna关键产品命运的法律诉讼。

Moderna已经四次获得了杨梅授权的Acuitas使用LNP技术的资格。但根据杨梅与Acuitas的原授权协议，Acuitas仅有权在“反义”和“基因治疗”两个领域使用LNP技术，同时限制授权产品必须由Acuitas开发，并在第二次授权时在动物模型中进行初步验证。因此，杨梅公司指控Moderna严重违反了与Acuitas的许可协议:Acuitas将基于LNP技术的所有专利和技术点许可给Moderna，而不是最初定义的两个治疗领域，也不是Acuitas开发和临床前验证的产品。

2018年2月，该裁决剥夺了Acuitas继续使用和重新许可LNP技术的权利。Moderna可以庆幸的是，虽然不能在其他领域使用LNP技术，但之前授权的四款产品仍保留使用权，Moderna将向杨梅支付费用。

Moderna表示，现在正在使用该公司开发的一种新的脂质体递送技术，但杨梅表示，根据Moderna发表的文献、报告和专利分析，Moderna很难在不依赖杨梅专利的情况下开发出有效的脂质体递送技术。所以不排除Moderna会继续陷入专利战。

Moderna的核苷修饰技术是另一起专利纠纷的焦点。

体外合成的mRNA具有较高的免疫原性，可能诱发大量的炎症反应。对人mRNA的免疫反应主要与尿苷(部分由尿嘧啶组成)有关，用假尿嘧啶代替尿嘧啶可以降低免疫系统对mRNA的识别。这种修改策略最早是由宾夕法尼亚大学发明的，最后卖给了Cellscript。

Moderna成立之初的重点之一就是寻找一种新的可以绕过假尿嘧啶专利的修饰方法，而且似乎成功了——Moderna发现了1-甲基假尿嘧啶，最终在2014年获得了多项专利授权。但有意思的是，2017年6月，Moderna仍然选择向Cellscipt购买伪尿苷修饰方法的专利权，并为专利权预付了7500万美元，以及每件产品2600万美元的里程碑付款和个位数的销售佣金。Moderna目前的产品线是否受到专利护城河的保护值得怀疑。

观点盛辉mRNA疫苗生产工艺简单，合成快速，成本低廉，具有激活免疫反应的佐剂作用。Moderna、CureVac等公司的融资额一直很高，但最快的临床试验也只进展到二期。由于动物环境和人体环境的巨大差异，该给药系统在人体内的效率和mRNA稳定性还需要大量的临床试验来进一步验证。

在国内，依托各大高校的科研专利，四维(上海)生物科技有限公司、艾博生物医药(杭州)有限公司、上海蓝雀生物医药有限公司在新冠肺炎的疫苗研发取得了重要进展。虽然它们尚未进入临床试验阶段，但其安全性和有效性有待证实。

目前，mRNA疫苗的研究主要集中在增强其稳定性、调节其免疫原性、开发新的递送技术和扩大疾病治疗范围等方面。开发成熟的药物还需要时间。

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