什么是酶切

限制酶（英语：Restriction enzyme）又称限制内切酶或限制性内切酶（restriction endonuclease），全称限制性核酸内切酶[1]，是一种能将双股DNA切开的酵素。切割方法是将糖类分子与磷酸之间的键结切断，进而于两条DNA链上各产生一个切口，且不破坏核苷酸与碱基。切割形式有两种，分别是可产生具有突出单股DNA的黏状末端，以及末端平整无凸起的平滑末端。[2]。由于断开的DNA片段可由另一种称为DNA连接酶的酵素黏合，因此染色体或DNA上不同的限制片段，得以经由剪接作用而结合在一起。

限制性内切酶酶切注意事项

在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件，酶切反应的设计 一般应注意以下问题 ：

①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；

②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

10酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。

11DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。

12要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量，酶反应才能有效地进行。

13反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。

14高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。

15反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。

16反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。

17用已硅化的离心管进行酶切反应，可获得更佳的酶切效果，否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。

18终止酶反应可根据需要采用不同的方法：

①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应；

②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以灭活酶终止反应。

③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。

二、限制性酶解中常见的问题及解决措施 ：

限制性酶切割DNA底物的操作过程中，会出现一些问题，产生的原因主要为酶解体系中各要素处于非最佳状态，包括DNA的纯度和特性，反应缓冲液、反应体积、反应时间及温度等。

酶切反应的注意点：

1 20ul体系是最佳体系

2 20ul体系最多切2ug的DNA

3 甘油的量最好是低于体系的5%，最大不超过10%

4 酶切效率和酶的质量，保护碱基，酶切位点的位置（同一段DNA不同位置可以差很远，就算是都在中间也是一样的），酶切位点状态（如位点及周围几个碱基是否被甲基化等，有些甲基化后切不开，有些恰好相反。DAN的空间结构、识别序列的侧翼序列、DNA来源也有影响）酶的量，DNA的量，体系的纯净度（比如杂质的干扰，很多杂质如乙醇等可以明显抑制酶活性,另外还有DNase，蛋白质，EDTA，SDS，盐离子，酚氯仿），buffer的选择，是否加BSA,DNA 的状态（比如超螺旋状态DNA酶切效率低5倍－－这也是不能1ug质粒用1u酶切的原因，也不能只切1h的原因），星号活力等（也是因为杂质干扰或者甘油太多，buffer不合适，酶活性不稳定）

5 一般不好的酶需要8倍的酶量，切2－4h。如果是比较好的酶可以4倍酶量切2－4h，甚至可以一倍酶量切10h以上。 做的不好的酶一来有杂质酶污染，切久了污染的酶产生的影响会很明显，相对的酶量用大些引起的杂质酶切割问题要小些，所以采用大酶量短时间。 二来不好的酶不稳定，时间长了识别位点会发生变化，造成乱切的情况。所以采用了大酶量短时间的方法，虽然有些浪费。 而比较好的酶则相反。

注意酶加BSA目的一可以稳定酶，低浓度酶容易降解。二可以减少管臂对酶非特异吸附。

最好用孵箱不要用水浴箱，因为国产货不稳一不小心就39去了，对酶活性杀伤较大，孵箱至少不会突然很热了

完全酶切：用足够的限制性内切酶以充分的时间去处理DNA分子,使DNA中所有可能的靶位点都被切割。

部分酶切：限制酶处理DNA时因酶量或反应时间不足,以致DNA的靶位点只有一部分被裂解。

两种酶切的优缺点：

完全酶切：长度不均一，是黏性末端，但有可能使目的基因断开，大小不可控。

部分酶切：片段长度可控，含有黏性末端便于连接，目的基因完整。

酶切鉴定需要培养大肠杆菌，抽提质粒后才能进行。缺点是耗时，优点是结果可靠。

菌落PCR只需用接种针或小枪头蘸一下菌落或菌液，再接入PCR体系中，通过PCR即可判断目标条带的存在。优点是获得结果快，缺点是可能有假阳性。

（1）温度：大部分限制性内切酶最适反应温度为37℃，少数酶高于或低于这个温度。

（2）时间：合适，大多为1h，可过夜反应。

（3）溶液体系：要求有稳定的pH环境。（4）盐离子浓度：不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同要求。

（5）反应体积和甘油浓度：在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。

（6）DNA的纯度和结构：DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应速度和酶切的完全度，酶切的底物一般是双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。

实验目的：

1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。

2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。

3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。

基本原理

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。

主要试剂

重组质粒DNA插入片段300bp

本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：

5′----G↓AATTC----3′

3′----CTTAA↑G----5′

磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。

操作步骤

1反应体系的建立：

⑴在一无菌15mlEppendorf管中加入：

无菌双蒸水7μl

10×酶切缓冲液2μl

质粒DNA(100ng/μl)10μl

EcoRⅠ(5U/μl)1μl

总体积为20μl

⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。

237℃水浴1h。

3将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。

412000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。

酶切技术

5取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100V30～60min。

6结果观察。

操作注意事项：

1吸样量一定要准确

2为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶

3要求在冰上操作，并充分混匀，

4开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

5样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败

。

限制性内切酶酶解中常见的问题和原因

1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。

2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。

3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。

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