高中生物里面，什么用到了差速离心法什么用到了梯度离心法

差速离心法（离心法）：交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。

梯度离心法（浓度梯度)：细胞内的物质具有一定的浓度，把细胞放入清水中，细胞吸水涨破。除去细胞内的其他物质，得到细胞膜。

密度梯度区带离心法（简称区带离心法），是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。

蔗糖密度梯度离心。

用蔗糖密度梯度离心法进行了禽脑脊髓炎病毒的纯化，为了研究高等植物细胞质膜上的质子泵ATP酶的作用机理，需要纯化细胞质膜，Hodges等首先使用蔗糖梯度法纯化燕麦根细胞质膜，广泛地应用着。

Lundborg等应用水溶性多聚体（PEG/Dextran）两相分配法纯化小麦根细胞质膜后，两相分配法在质膜纯化上逐步引人注意，被认为是一种优于蔗糖梯度法的方法，Lundborg等用两相分配法分。

蔗糖密度梯度离心，将禽脑脊髓炎病毒（AEV）L2Z株、Van Roekel株和1143株分别经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，接毒后，以4500r/min离心及胰腺，用玻璃匀浆器制成10%的组织悬液。组织悬液经3次反复冻融后，以4500r/min离心15min，取上清液。

而后用氯仿处理，取水相，经冷冻真空浓缩，进行不连续蔗糖密度梯度离心。取出含AEV的组分，用PBS稀后超速离心除去蔗糖。亦称平衡密度梯度离心法。

纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。其过程如下：

1、将收集的组织或脏器或其他，用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3次后，置-20 ℃冰箱中，备用。

2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清液。

3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。

4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30% , 45% , 60%的蔗糖，加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心25h，发现在30%与45%以及45%与60%之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。

5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h，用少量STE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。

1 差速沉降离心法：

这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。

差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2～3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。

此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。

2 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：

区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。

密度梯度区带离心法又可分为两种：

（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。

离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达128 kg/cm3和60％。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 。

（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。

离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。

等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。

等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达17 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。

收集区带的方法有许多种，例如：

（1） 用注射器和滴管由离心管上部吸出。

（2） 有针刺穿离心管底部滴出。

（3） 用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。

（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。

主要有差速离心和密度梯度离心 ：一般是先用差速离心初分离，再用密度梯度离心进一步分离。

以下详细：

细胞器的分离

细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成，细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等，这些也称作亚细胞组分。对于细胞的结构和功能的研究，是细胞生物学的基本课题，其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。

一、差速离心（differentialcentrifugation）

在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。

速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀

在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。

由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。

差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。

密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）

用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。

A等速度沉降，B等密度沉降

二、密度梯度离心

速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。

等密度沉降（isopycnicsedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。

叶绿体的分离

实验方法

1选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃匀浆器中，加入10ml035MNaCl溶液，匀浆3～5min。

2匀浆液用4层纱布过滤于50ml烧杯中。

3将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃去沉淀。

4将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。

5将沉淀用035MNaCl溶液悬浮，取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察：

①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察。

实验结果

1普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。

2荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体发出火红色荧光

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