如何除去密度梯度离心法分离获得的PBMC其中含有的大量单核细胞

密度梯度离心法分离PBMC

1　在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。

2　取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。

3 水平离心400g×30分钟。（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1，降速为0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。）

4　离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

淋巴细胞分离液

单个核细胞

血浆和PBS

红细胞和粒细胞

5　去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

6　末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。

7 加入10mL PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

8 末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。

用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106PBMC，不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在95％以上。

注意：

1 所有操作都应在无菌条件下进行。

2 在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。

3 吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集

差速离心法（离心法）：交替使用低速和高速离心,用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离

梯度离心法（浓度梯度)：细胞内的物质具有一定的浓度,把细胞放入清水中,细胞吸水涨破除去细胞内的其他物质,得到细胞膜

percoll和淋巴细胞分离液（淋分）都是利用细胞密度不同来分离细胞的，但是percoll区分的密度梯度更多，就是如果几种细胞密度相差不多时，percoll依然能分开，可是普通的淋分就无能为力了，也可以认为，percoll分离的细胞纯度更高，

Ficoll与Percoll均为密度梯度离心法

①Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1092左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为1075左右。利用密度在1077±0001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液,故位于分层液界面上,这样就可获得PBMC。

②Percoll密度梯度离心法：Percoll是Pharmacia公司的商品名，成分为硅化聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，为无毒，无刺激的新型密度梯度离心分离剂。聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液，它具有易成等渗、粘度低、无毒性、不引起细胞聚集等优点，已得到广泛引用。由于Percoll在培养基中颗粒大小不等，其在离心过程中自然形成密度梯度，从而将不同密度的细胞分离出来。将1份10×PBS与9份percoll储存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100 % Percoll悬液，其密度为11294g/ml,可通过用PBS(1x)或组织培养液稀释此100%Percoll而获得适宜密度进行细胞分离，因为稀释度与密度线性相关，常用的密度如下：

70% Percoll 1090g/ml

60% Percoll 1077g/ml

50% Percoll 1067g/ml

40% Percoll 1056g/ml

30% Percoll 1043g/ml

20% Percoll 1031g/ml

通过几个由高到低稀释度的叠加,形成与混合细胞的各组分细胞相应比重的梯度,达到可以将不同密度的细胞区分开来

一句话总结:Ficoll只能分离出密度在1077±0001g/L之间的淋巴细胞,PERCOLL能将全血中的多种细胞分离出来,若只分离淋巴细胞,可以用普通淋巴细胞分离液

1 差速沉降离心法：

这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。

差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2～3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。

此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。

2 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：

区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。

密度梯度区带离心法又可分为两种：

（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。

离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达128 kg/cm3和60％。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 。

（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。

离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。

等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。

等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达17 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。

收集区带的方法有许多种，例如：

（1） 用注射器和滴管由离心管上部吸出。

（2） 有针刺穿离心管底部滴出。

（3） 用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。

（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。

用

钻空子

的思想来说的话,,,

肯定不纯,,,

细胞破碎

时,,细胞中的某些组分很可能变成和

叶绿体

一样的大小,

平衡

密度梯度离心法

。用超

离心机

对小分子物质溶液，长时间加一个

离心力

场达到

沉降平衡

，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量

大分子溶液

，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物

原理嘛,通俗来就说就是按重量来分的

正常人思维,以上因素是不考虑的,,,,因为,细胞中的某些组分很可能变成和叶绿体一样的大小,的概率只有

天才知道

,,,

只要知道原理就好理解,,

再有就是吸取时,可能有误差,,

过程如下

1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃

匀浆

器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3

次后,置-

20

℃冰箱中,备用。

2、先以

5000g

离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。

3、接着10万g

超速离心

2h，将沉淀用少量STE溶解。

4、先在超速

离心管

中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的

溶解液

，然后在离心管中依次加入30

%

,

45

%

,

60

%的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心25h,发现在30

%与45

%

以及45

%

与60

%之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。

5、去蔗糖；用STE

缓冲液

适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用

分光光度计

测定其病毒含量。

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