测定蛋白质浓度的方法有,五种蛋白质浓度测定方法的优缺点

蛋白质检测方法（蛋白质浓度测定常用的三种方法）

鸡蛋白质检测方法(蛋白质浓度测定的三种常用方法)

紫外线法

这种方法是在280nm波长下直接检测蛋白质。选择Warburg公式，光度计可以直接显示样品的浓度，或者选择相应的转换方法将吸光度值转换成样品的浓度。蛋白质的测定过程很简单，先测空白色溶液，然后直接测蛋白质。所以结果很不稳定。蛋白质直接定量法适用于检测成分相对单一的纯蛋白质。与比色法相比，紫外直接定量法快速、易操作。但是容易被平行物质干扰，比如DNA另外灵敏度低，蛋白浓度高。

(1)简单经验公式蛋白质浓度(mg/ml)=[1.45 * od 280-0.74 * od 260]*稀释系数

(2)精确计算:计算OD280/OD260的比值，然后查表得到修正系数F，再用下面的公式计算出最终结果:

蛋白质(毫克/毫升)= F *(1/天)*外径280 *天

其中d是用于测量OD值的比色皿的厚度

d是溶液的稀释倍数

BCA方法

BCA(bicinchoninic acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂混合形成苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，工作试剂由苹果绿变为紫色化合物。562 nm处的光吸收强度与蛋白质的浓度成正比。

BCA蛋白质浓度测定试剂盒，Abbkine的蛋白质定量试剂盒(BCA法)提供了一种简单、快速且与洗涤剂兼容的方法来准确定量总蛋白质。

成分100 mL试剂B2 mL标准蛋白(BSA)1mL×2 2.1mg/mL

储存条件和运输温度:室温(标准蛋白在4 ~ 8℃运输)

储存温度:室温(标准蛋白-20℃储存)

生效日期:12个月

施用方式

方法1: 96孔板

1.BCA工作液的配制:根据标准品和样品的数量，按50倍体积的A试剂和1倍体积的b试剂配制适量的BCA工作液，混匀。

2.按照0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL和10 μL，将蛋白质标准加入96孔板的蛋白质标准孔中，加入灭菌的双蒸水至10 μL..将10 μL待测样品加入96孔板的样品孔中。每次测量应平行进行2 ~ 3次。

3.向待测样品孔和蛋白质标准孔中加入200 μL BCA工作液(即样品与工作液的体积比为1:20 ),混匀。

4.37℃水浴30分钟。冷却至室温。

5.用酶标仪在562 nm波长下测定吸光度。

6.画一条标准曲线。从标准曲线计算样品浓度。

蛋白质浓度测定的三种常用方法(详解)
方法二:试管法。

1.工作溶液的配制:根据标准品和样品的量，按50倍体积的A试剂和1倍体积的B试剂配制适量的BCA工作溶液，并充分混合。制备的工作溶液的量应对应于测定中使用的比色杯。每次测量应平行进行2 ~ 3次。这里列出的比色系统使用0.5毫升比色杯。如果比色皿的规格不同，则需要将系统放大到准确读取实验中使用的比色皿所需的体积。

2.BSA标准品和样品的制备:样品用水或其他不干扰显色反应的缓冲液制备，使待测浓度位于标准曲线的线性部分。为每个反应准备三个平行分析。标准曲线通常为5~6点。根据样品的估计浓度，确定每个点的具体浓度。BSA可以用水或与样品一致的溶液稀释。如果待测样品的浓度约为200 μg/mL，可按以下顺序加入BSA标准、样品和BCA工作溶液。

3.取适量标准蛋白，按蛋白溶液:工作溶液=1:20的比例混合均匀。37℃水浴30分钟。冷却至室温。

4.在562 nm波长下测量样品和标准品的吸光度。

蛋白质浓度测定的三种常用方法(详细说明)
考马斯亮蓝法

原理考马斯亮蓝法是一种利用蛋白质-染料结合原理定量测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定方法与其他方法相比具有突出的优点，因此被广泛应用。目前，该方法是最灵敏的蛋白质测定方法之一。

科斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色由棕黑色变为蓝色。通过测量595 nm处光吸收的增加，可以知道与之结合的蛋白质的量。发现染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合。

突出优点:(1)灵敏度高，估计比Lowry法高4倍左右，蛋白质最低检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后颜色变化较大，蛋白质-染料复合物消光系数较高，因此光吸收值随蛋白质浓度的变化远大于Lowry法。

(2)测定快速简单，只需加入一种试剂。完成一个样品的测定只需要大约5分钟。由于染料与蛋白质结合的过程可在2分钟左右完成，其颜色可在1小时内保持稳定，5分钟至20分钟之间颜色稳定性最好。因此，它不像Lowry的方法那样耗时，并且需要严格控制时间。

(3)干扰物质少。如K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等，它们干扰Lowry法，不干扰本法。

缺点(1)由于各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考马斯亮蓝染色法对不同蛋白质的测定偏差较大。制作标准曲线时，通常使用g-球蛋白作为标准蛋白来减少这种偏差。

(2)仍有一些物质干扰本方法的测定。主要干扰物质有洗涤剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

试剂和设备。试剂考马斯亮蓝试剂:

科斯亮蓝G-250 100 mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。

2.待测标准和蛋白质溶液(1)标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白，预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量。根据其纯度，用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白质溶液。

(2)待测蛋白质溶液。人血清，使用前用0.15 mol/L NaCl稀释200倍。

3.设备试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管0.5mL(×2)；1毫升(×2)；5ml(×1)；恒温水浴；分光计。

方法一:制作标准曲线，取7支试管，按下表平行操作。

摇匀，1 h内用0号管作为空白色对照，在595 nm处比色。

绘制标准曲线:以595 nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二。未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上。取适当的未知样品体积，使测定值在标准曲线的直线范围内。根据测得的A595 nm值，在标准曲线上找到相当于标准蛋白的A595 nm的量，并计算未知样品的蛋白浓度(mg/mL)。

注(1)在加入试剂后5-20分钟内测量光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。

(2)在测定过程中，一小部分蛋白质-染料复合物将被吸附在比色皿的壁上。测定后，可以用乙醇清洗蓝色比色皿。

(3)用考马斯亮蓝法分析蛋白质必须掌握分光光度计的正确使用。重复测量吸光度时，比色皿必须清洗干净。制作蛋白质标准曲线时，最好从低浓度到高浓度测量蛋白质标准，以防出错。

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